柠檬酸发酵实验指导书.pdfVIP

柠檬酸发酵实验指导书 第二部分 柠檬酸发酵实验 一、目的要求 了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流程，掌握柠檬酸的发酵生产工艺与发酵分 析方法。通过本实验能较熟练地掌握真菌发酵的接种、培养与发酵产物的分析测 定等技术。 二、基本原理 黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强；pH1.6~1.7 时尚能生长，且酸度大时产生葡萄 糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以 pH2~3 为宜。 用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等；本实验以糖等为发酵原料，黑曲 霉为产生菌。在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、 乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。挥发酸和非挥发酸的总和 称总酸。酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等；若待测液色泽很 深，可采用外指示剂法。本试验用中和法测定柠檬酸发酵中的总酸；柠檬酸的定 性检验用 Deniges 试剂。 三、实验材料 1．菌种 黑曲霉斜面菌种。 2 ．实验器材 0.1mol ／L 标准 NaOH ； 0.1mol ／L H S0 ；展开剂：正丁醇：甲酸：水=40 ： 2 4 55：5； Deniges 试剂(HgO 1g 溶于 20ml 0.2L ／L H S0 中) ； 2 4 酒精灯；滤纸，漏斗；烧杯：200ml ，500ml；18X180 试管；吸管 10ml、5ml，150ml 三角瓶；碱滴定管，铁台、蝴蝶夹：酚酞指示剂：200ml 量筒；广范 pH 试纸；pH 酸度计；玻璃棒；布氏漏斗，抽滤纸，抽滤水泵，离心机和离心管，滴管，天平。 层析缸（ø 10cm×15cm）、毛细管(ø 0.5mm)、玻棒、喷雾器、烘箱、尺、铅笔、 干燥器，等。 柠檬酸发酵培养基：硝酸铵 2.0g ，KH P0 1.0g，MgS0 0.25g ，蔗糖 150g，水 2 4 4 1000ml；pH 控制在 5.5~6.5 左右，加 1mol ／L NaOH 约 2 滴。取 100ml 上述培 养液，加入 500ml 或 300ml 三角瓶中，包扎灭菌，待用。 四、实验步骤（实验内容） 预备实验： 斜面培养基制备：可用 PDA 培养基或其它霉菌培养基，用于霉菌的培养。 发酵培养基的制备：参见实验器材中的柠檬酸发酵培养基及其制作方法。 第 1 页 柠檬酸发酵实验指导书 1．菌种活化与种子的制备 菌种活化：对于已长久保存的菌种，需经斜面培养基活化培养一次，即取保存 的斜面菌种黑曲霉，移至斜面培养基，经 25~28 ℃斜面培养至孢子长好，作为活 化后的种子（由实验员准备）。发酵用的种子制备：用同样方法，移接斜面培养 基，得到的培养物作为发酵用的种子。 2 ．接种与发酵 取柠檬酸发酵培养基（液）3 瓶，用接种环向每瓶接入黑曲霉孢 子 2~3 环，26~28 ℃摇床培养 5~7d，摇床转速 120~150rpm，另 1 瓶不接种留 作对照。 注意：观察细胞生长情况及变化并记录；观察发酵过程中 pH 的变化并记录。 当pH3 左右是积累柠檬酸的最佳时期。 3 ．发酵液预处理 取发酵液经过滤 将 3 瓶培养液一并过滤，菌丝用蒸馏水略加洗涤后弃去。 4.发酵产物的检验与分析 定性检验（略）： 取过滤液和对照液各约 5ml，放入试管内，加 Deniges 液 lml ，在酒精灯上缓缓加热至沸。逐滴加入 20g ／L KMn04 溶液，若有柠檬酸存在， 则出现白色沉淀。 纸层析法：展开剂：正丁醇：甲酸：水=40 ：55：5 （V/V/V ）；显色剂：0.25g 的甲基红和0.25g 的溴酚蓝溶于 100mL 70% 的乙醇中，再用 0.1mol/L 的NaOH 调成蓝绿色。层析纸：新华层析纸 5 号，裁成 14cm×23cm，裁剪时，纤维长丝 方向与窄边平行，与长边垂直。 方法：将展开剂配好后在钟罩内平衡 3 小时，在层析纸上距底边处用铅笔划一 条直线 （约距离层析液