2.4.1 基因组文库的构建.pdf

基因组文库的构建 LOGO 文库 含有某种生物全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。如果文库的容量足够大 ， 就能包含该物种的或改组织全部DNA或RNA （以cDNA的形式 ）的序列。分为基因 组文库和cDNA文库。 基因组文库 含有某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存在一个受体菌的群体之中 ，这个群体就是这种生物的基因组文库来 自于某一物种的基因组 ，由于该物种所有 组织中的基因组均相同 ，所以基因组文库具有种属特异性 ，但无组织特异性。 基因组文库的大小 一个理想的基因组文库应该是在克隆群体中包含完整基因组的所有DNA序列 ，一般 情况下一个完整的基因组文库所需的克隆总数应取决于外面基因组的大小以及切割 片段的大小。估算基因组文库大小的公式 ： ln (1-P) N ln (1-f ) N为基因组文库必需的克隆数 目 P为文库中含 目的基因DNA片段的出现概率 f为插入片段的大小与全基因组大小的比值 基因组文库的大小 举例 6 如果要使20kb大小的基因DNA片段出现概率达到99% ，则构建大肠杆菌 （4.6×10 ） 9 和人类 （3×10 ）的基因组文库应包含的克隆子经验值分别是 ： ln( 1-0.99) N E.coli = = 1.1 ×103 4 6 ln[1-(2×10 /4.6×10 )] ln(1-0.99) 5 Nhuman = 6.9 ×10 4 9 ln[1-(2 ×10 / 3 ×10 )] 构建基因组文库的步骤 1、纯化基因组DNA 2、获得含基因组文库的DNA片段 3、与λ噬菌体克隆载体重组 构建基因组文库的步骤 （1 ）基因组DNA的纯化 真核生物的从细胞核中提取 ，用蛋白酶和梯度抽提的方法去除蛋白质、脂肪和不 需要的大分子物质。 原核生物可直接从细胞中提取 构建基因组文库的步骤 （2 ）将DNA进行随机切割 方法一 ：物理学方法 ，如利用机械力和超声波等 方法二 ：生物化学方法 ，如限制性核酸内切酶。 构建基因组文库的步骤 根据插入片段的大小 ，可以选择不同的载体来构建基因组文库 载体 Plasmid phageλ cosmid YAC 插入片段(kb) 5 23 45 1000 构建基因组文库的步骤 左臂 右臂 cos cos 外源 DNA (~20-23 kb) 左臂 右臂