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PCR 扩增产物的分析方法 • 微孔板夹心杂交法 • 颜色互补分析法 • PCR-ELISA 法 • PCR-OLA 法 • PCR-打点杂交法 微孔板夹心杂交法： 该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR 产物的某一区域特 异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等 非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次 杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物， 因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV 的检测，其敏感度可达5 个HBVDNA 分子。此法的敏感性和特异性与 PCR32P 探针的Southern 杂交法相当。但PCR 微孔板夹心杂交法操作简 便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常 规应 用的ELISA ，适于临床实验室常规应用。另一种微孔板杂交法不 是采用夹心法，而是直接将特异探针固定微孔板上，然后用生物素 标 记的PCR 产物杂交。微孔板杂交与膜印迹杂交相比，有如下优点：①前者易操作；②固相微孔板漂洗时间短，节省了检测时间，因为 膜 杂交过程中，反应剂要浸透膜中，漂洗时，使反应剂全部浸出需 要时间较长；③本底低，微孔板杂交不需Dehatdt 液和预杂交以及封 闭 过程。另外，微孔板固定的DNA 不需再加热或UV 照射。 微孔板杂交的基本过程包括L ：DNA 的固定，探针的杂交和酶联显色。 DNA 的固定 在一定盐浓度条件下，DNA 单链的一端可固定在微孔板上。不同来源 的微孔板固定DNA 时所需盐浓度不同。因此，必须用一系列 的盐浓度 （0.15mol/L 至3.0mol/LNaCl ）来固定加热变性的核酸，然后，用固 定浓度的标记探针杂交。显色后，判断合适的固定盐浓度。 固定方 法的选择必须使DNA 最大量的固定，且不影响杂交。用合适浓度的 NaCl 或(NH ) SO 可达到此目的。硫氰酸钠则无固定作用。 4 2 4 盐浓度合 适时，DNA 应为一端固定到微孔板上，而太低或太高浓度的盐可能使 DNA“平躺” 固定在孔内而影响杂交。Mg2+ 虽有促进DNA 固定的作 用，但它可激活Dnase ，所以，一般不用。被固定的DNA 应大于300bp ， 否则影响杂交结果。每孔可固定高达200ng(624bp) 的DNA 。合适的盐 浓和固定量一经确定，可按下法固定DNA 。 待固定DNA100 ℃加热5min 变性并立即冷却。 与合适的固定液混合后，加入微孔板的孔内。固定液：10mmol/L 磷 酸钠- 10mmol/LEDTA ，pH7.0 ，合适浓度的NaCl （与DNA 变性 混合后， 终浓度为最适固定浓度）。 用胶布封好，浸于37 ℃水浴2h 。 用PBS-0.05%Tween20 漂洗3 次。 立即用于杂交，或封闭于塑料袋内保存。 杂交 可采用标准的杂交系统杂交。夹心杂交时，是将变性的PCR 产物与检 测探针一并加。杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短。 显色 1 根据不同酶标检测分子的不同选择不同的底物、终止剂和测定波 长。 颜色互补分析法(A) 颜色互补分析法是利用三原色原理，当不同DNA 片段（A 和B ）同时扩增时，用引 物5’端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素 标记（A 片段引物标记绿色的荧 光素，B 标记红色的罗丹明）。如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有 一种颜色（红色或 绿色）。如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分离，紫 外激发后可观察到不同颜色的两条带。如果两条被扩增片段大小相同， 电泳后可见一 条红绿互补色-黄色带。如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除未掺入引 物，亦可观察到扩增产物的颜色。此时， 扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见 一条红绿互补的黄色条带。 该法简便、易于自动化，可用于检测基因，缺失、染色体转位和病原微生物。这种情 况下，只需判断产物的有无。另外，在检测多 种基因实变、多种病原菌和HLA 分型 时，可用复合PCR 。此时，不同引物可用不同荧光素标记（如绿色的ROX ；蓝色的COUM 等）。 PCR-ELISA