基质蛋白PfY2矿化功能研究及珍珠层蛋白复合物的鉴定.pdfVIP

摘  要  摘 要 合浦珠母贝（Pinctada fucata ）作为我国重要的海水珍珠养殖贝类，其珍珠与 贝壳的形成是生物矿化领域的研究热点所在，由外套膜分泌产生的基质蛋白在矿 化过程中起到了非常关键的调控作用。本研究着眼于基质蛋白 PfY2 和珍珠层可溶 性基质蛋白复合物，来探究它们对合浦珠母贝贝壳形成的调控影响。 我们根据幼贝不同发育阶段的基因表达谱芯片筛选并鉴定得到了一个全新的 碱性基质蛋白 PfY2 ，其 cDNA 共编码了 111 个氨基酸残基，成熟蛋白约为 11.9 kDa， 理论等电点为 8.9。对其在不同组织中的表达分布检测结果表明，PfY2 高表达于外 套膜的边缘区与缘膜区，与其同时定位于贝壳棱柱层与珍珠层的可溶性组份相对 应。利用 RNA 干扰技术特异性敲低其表达后，我们发现贝壳新生棱柱层与珍珠层 都出现了不同程度的过度生长，因此我们猜测PfY2 可能会抑制碳酸钙晶体的沉积。 随后，我们利用大肠杆菌原核表达系统对其进行表达纯化，得到了重组蛋白 rPfY2 ， 证实了它与方解石和文石具有特异性的结合能力后，我们又通过方解石和文石的 体外结晶实验，模拟了它对贝壳生长的影响。发现 rPfY2 可以参与碳酸钙晶体的 成核，抑制碳酸钙晶体的结晶速率与晶体的生长，对无定形碳酸钙 ACC 向方解石 和文石的转化也起到了显著的抑制作用。综合以上结果，我们认为基质蛋白 PfY2 可能作为一个负调控因子，参与维持贝壳的矿化平衡。 此外，我们利用非变性凝胶电泳首次证实了合浦珠母贝贝壳珍珠层至少形成 了一种可溶性蛋白复合物，质谱鉴定表明该复合物由多种不同的基质蛋白组成。 免疫共沉淀和蛋白的体外结合实验验证了质谱分析中 Mascot 排名前两位的蛋白 ESN1 和 ESN2 之间的确存在相互作用。另一方面，我们首次利用包涵体复性的方 法纯化得到合浦珠母贝中的重组基质蛋白 rESN1 与 rESN2 ，二者依然具备与碳酸 钙晶体的特异性结合能力且二者共定位于体外合成的方解石和文石中。对它们在 贝壳中的矿化功能研究发现，二者可以通过稳定球文石来抑制方解石晶体的生长， 同时可以在极低浓度的镁离子条件（5 mM ）下，诱导文石晶体的形成。 综上所述，基质蛋白 PfY2 和珍珠层可溶性蛋白复合物均参与了贝壳矿化的调 控，对它们作用机制的深入探索将进一步丰富我们对基质蛋白调控贝壳形成的分 子机理研究。 关键词：合浦珠母贝；基质蛋白；蛋白复合物；贝壳形成；生物矿化 I 目  录  目 录 第1章 前言 1 1.1 生物矿化概述 1 1.2 合浦珠母贝贝壳的生物矿化 2 1.2.1 合浦珠母贝贝壳的主要组成与结构 2 1.2.2 合浦珠母贝贝壳的形成 5 1.2.3 合浦珠母贝幼贝发育与早期贝壳的形成 7 1.3 基质蛋白参与调控贝壳的形成 9 1.3.1 基质蛋白概述 9 1.3.2 基质蛋白的获取 13 1.3.3 基质蛋白的结构与功能研究 15 1.3.4 基质蛋白的筛选与鉴定 21 1.3.5 合浦珠母贝中基质蛋白之间的相互作用 22 1.4 基质蛋白研究过程中尚未解决的科学问题 24 1.5 选题目的及意义 25 1.6 论文结构 26 第2章 实验材料与方法 27 2.1 实验动物 27 2.2 合浦珠母贝中不同组织 RNA 的提取 27 2.2.1 总 RNA 的提取 27 2.2.2 RNA 的质量检测与定量 28 2.3 矿化基因 cDNA 全长的克隆及获取 28