褪黑素通过调控成骨_破骨分化平衡延缓骨质疏松症进程的机制研究.pdfVIP

浙江大学博士学位论文 中文摘要 研究方法 1.建立C57BL/6J 背景去势雌性小鼠骨质疏松模型，给予褪黑素治疗，通过μCT 和HE 染色观察骨骼微结构改变，通过qRT-PCR、免疫组化和ELISA 检测各个 成骨、破骨和炎症相关指标在骨组织及血清中的表达水平。 2. shRNA melatonin receptor,MT 使用搭载 的慢病毒敲减细胞内褪黑素受体 （ 受体）后，通过ALP 染色、茜素红染色、qRT-PCR、ELISA 和westernblot 明确褪 黑素及其受体对BMMSCs 成骨分化能力的影响，探索褪黑素、MT 受体、NF-κB 通路之间的关系，并用NF-κB 抑制剂JSH-23 验证该通路在其中的作用。 3.分别建立直接接触、非直接接触共培养体系，研究BMMSCs 与破骨前体细 胞之间相互作用的模式，通过TRAP 染色、westernblot 评估破骨细胞分化成熟的 水平，并探讨褪黑素在整个过程中的作用。 研究结果 1.褪黑素显著提高了骨组织、血清中成骨相关基因的转录水平和蛋白的翻译水 平，明显抑制了破骨相关蛋白及炎症因子的表达，有效缓解了骨质疏松小鼠的骨 流失，改善了紊乱的骨微结构。 2. 10-100nM BMMSCs 近生理浓度的褪黑素 （ ）有效提高了 的成骨分化能力， 在表象上表现为BMMSCs 的ALP 水平、钙化结节明显增加，在分子水平上表现 为Runx2、Osterix、OCN 显著升高，但Col-I 水平不受影响。 3.褪黑素主要通过MT2 受体调节BMMSCs 的成骨分化能力。敲减BMMSCs MT2 ALP Runx2 Osterix 的 受体后，褪黑素提高其成骨分化能力 （表现为 、 、 和 OCN 表达水平升高，矿化结节生成增加）的作用被显著削弱；而当MT1受体被敲 减后，BMMSCs 的成骨分化能力无显著变化。 4.褪黑素通过抑制MT2 受体-NF-κB 通路提高BMMSCs 的成骨分化能力。褪 III 浙江大学博士学位论文 中文摘要 黑素处理BMMSCs 后，细胞内IκBα、p65、IKKα/β的磷酸化水平明显降低，提示 NF-κB 通路被显著抑制；敲减MT2 受体后，褪黑素诱导的NF-κB 通路的抑制状态 被缓解，而敲减MT1受体无此作用；此外，抑制NF-κB 通路具有协同褪黑素促进 BMMSCs 成骨分化的作用。 5.褪黑素不直接影响破骨细胞分化，但可以通过MT2 受体-NF-κB 通路抑制 BMMSCs RANKL opg/rankl 中 的产生，并提高 比值。 6.褪黑素通过MT2 受体-NF-κB 通路调节BMMSCs 的旁分泌功能，继而间接 抑制破骨细胞分化。在BMMSCs 与破骨前体细胞非直接接触共培养体系中，我们 发现褪黑素间接抑制了破骨细胞分化；但在直接接触共培养体系中，未观察到该 BMMSCs RANKL NF-κB 现象。另外，与 中 的产生规律一致的是，抑制 通路能促 进褪黑素的破骨抑制作用，MT1受体敲减对该过程无任何影响，而MT2 受体敲减 却显著减弱了褪黑素的破骨抑制作用。 结论 本研究证实，褪黑素在延缓骨质疏松进展中有效地发挥了维持骨