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微生物试验报告 微生物的大小及数量的测定 一、 实验目的 了解显微镜测定微生物大小与血球计数板测定微生物数量的原理。 学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术，包括目镜测微尺、镜台测微尺的校正技术与测定细胞大小的技术。 了解血球计数板的结构，学习并掌握血球计数板计数微生物数量的技术，包括样品的点样、菌数计数的方法与计算。 二、 实验原理 微生物大小测定原理 微生物细胞的大小， 是微生物重要的形态特征之一， 也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小、 只能在显微镜下来测量。 用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。 （1） 目镜测微尺 （图 1） 目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把 5mm长度刻成 50 等分，或把 10 mm长度刻成 100 等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上 ( 此处正好与物镜放大的中间像重叠 ) 来测量经显微镜放大后的细胞物象。 由于不同目镜、 物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜 测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 图 1 目镜测微尺 图 2 镜台测微尺 2） 镜台测微尺 （图 2） 镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将 lmm等分为 100 格，每格长 l0 μ m（即 0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要 经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 1 微生物试验报告 血球计数板测定微生物数量的原理 镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液， 如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板； 一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽 (Petroff Hausser) 细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故 细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有 4 条槽而构成 3 个平台。中 间的平台较宽， 其中间又被一短横槽分隔成两半， 每个半边上面各有一个方格网 ( 图 3) 。每个方格网共分 9 大格，其中间的一大格 ( 又称为计数室 ) 常被用作微生 物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为 16 个中方格，而每个中方 格又分成 25 个小方格；另一种是一个大方格分成 25 个中方格，而每个中方格又 分成 16 个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即 每个大方格都由 400 个小方格组成 ( 图 4) 。 2 每个大方格边长为 1mm，则每一大方格的面积为 1mm，每个小方格的面积为 2 0.1mm，所以每个 1／400mm，盖上盖玻片后， 盖玻片与计数室底部之间的高度为 3 3 计数室 ( 大方格 ) 的体积为 0.1mm，每个小方格的体积为 l ／4000mm。使用血球计数板直接计数时， 先要测定每个小方格 ( 或中方格 ) 中微生物的数量， 再换算成每毫升菌液 ( 或每克样品 ) 中微生物细胞的数量。 图 3 血球计数扳的构造 平面图 ( 中间平台分为两半，各半边有一个方格网) 侧面图 ( 中间平台与盖玻片之间有高度为0.1 毫米的间隙 ) 2 微生物试验报告 图 4 血球计数板计数网的分区和分格 三、 实验材料 仪器 显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板、盖玻片（ 22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸，酒精灯 材料 酵母菌液，枯草芽孢杆菌斜面培养物3．试剂 美兰染液，结晶紫，蒸馏水等 四、 实验方法 1． 目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看 清镜台测微尺的刻度后， 转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行， 移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“ 0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度， 计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长 l0 μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 两重合线间镜台测微尺的格数 ×10 目镜测微尺每格长度（ μm） = 两重合线间目镜测微尺的格数 用此法分别校正在物镜倍数为 10×，40×， 100×下目镜测