登革2型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研究..docx

登革 2 型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研 究 登革病毒 (Dengue virus,DV) 是黄病毒属的一个血清学亚群 , 它包括 4 个不同的 血清型,引起的登革热 (Dengue fever,DF) 是一种急性发热性传染病 , 这种疾病 有时发展成登革出血热及登革休克综合征 (Dengue hemorrhagic fever, DHF 或 Dengue shock syndrome, DSS), 常可导致患者死亡。登革热的流行是热带和亚 热带地区一个严重的公共卫生问题 , 亚热带地区至少基金项目 : 浙江省科技厅重 点项目(2001136) 作者单位:浙江省疾病预防控制中心 (杭州 310009) 作者简介 : 夏时畅(1962 ), 男,浙江富阳人 ,副主任医师 ,中心副主任 , 主要从事传染病流行 病学研究。有 8 个国家流行该病。登革出血热是引起儿童住院和死亡的十大原 因之一,自 1978年以来,我国南方就发生了 7次流行,它严重危害着人们的健 康。浙江省在 1929 年发生过一次登革热流行〔 1〕,间隔 76年后,于 2004 年 7-10 月又由泰国输入病例引起浙江省本地 113 例登革热病例的局部流行。 2004 年 10 月浙江省杭州市又报告了 1 例输入性疑似登革热病例。为了对该病例及时 做出实验室确诊 ,分析毒株的基因变异和种系进化特征 , 从分子水平追踪传染源 , 我们采集了患者血清标本 , 进行了登革热血清学、病原学和分子生物学特征研 究。 材料与方法 患者及标本来源 周某某,2004 年 10月 8日从马尔代夫归国 ,发病前曾在 该国居住了 1个月左右,10 月 12日高热不退 ,在浙江大学医学院附属第一医院 就诊,无法诊断,然后转至杭州市第六人民医院 (传染病医院 )就诊,主要临床表现 为发热、头痛、肌痛伴淋巴结肿大。从马尔代夫大使馆得知 , 当时马尔代夫流行 登革热。 10月 12日采集患者第 1份血清,10 月 17 日采集第 2 份血清,带冰运送 到实验室。 血清抗体测定 登革热IgM和IgG抗体测定采用ELISA和间接免疫荧光试 验(IFA),ELISA和IFA试剂分别购自广州市中山生物工程有限公司和中国疾病 预防控制中心病毒病预防控制所 , 实验均按试剂盒说明书进行。 病毒分离 采用C6/36和BHK-21细胞分离患者早期血清样本中登革病 毒。C6/36细胞株从广州市疾病预防控制中心获得,BHK-21细胞由本实验室液氮 保存复苏。病毒分离按常规方法进行〔 1〕。 病毒RNA提取 采用德国QIAGEN^司的RNeasy mini Kit, 按照试剂盒说 明书进行,取血清标本或病毒分离阳性物 200 ^1提取病毒RNA最终收集RNA提 取液30卩l 。 病毒核酸检测和型别鉴定 采用登革热型特异性荧光RT-PCF方法进行核 酸检测和型别鉴定〔2〕,本实验室对荧光RT-PCR方法的特异性、敏感性和重复 性均进行了验证。引物和探针由上海博亚生物科技有限公司合成。 RT-PCR扩增E基因和NS1基因。引物设计：参照GenBank登革2型病毒 核苷酸序列设计引物。E基因测序引物为:Den-2(E)F1:AAC ATG GAT GTC ATC AGA AGG; Den-2(E)R1:CCA ATC TTG TTA CTG AGC G扩增片段为 1850 bp。 NS1 基因测序引物为:Den-2(NS1)F1:AGT GGG GTY TCA TGG ACT ATG; Den-2 (NS1) R1: TTA GGC TGC TAG TAG GGC AAG扩增片段为 1440 bp。引物由上海 博亚生物科技有限公司合成。 RT-PCF采用Roche公司的Titan one tube RT- PCR Kit进行。反应体系为50卩l,反应液组成：双蒸水19.5卩l、dNTPmix (10 mmol/L) 4 卩 l、DTT (5 mnol/L) 2.5 卩 l、RNase inhibitor(5 U)1 卩 l、上游和 下游引物(20 卩 mol/L)各 1卩 l、5X RT- PCR buffer 10 卩 l、Emix 1 卩 l、RNA提 取液10卩l。反应条件为:50 C 40 min逆转录,94 C 2 min后,94 C 30 s、 51T 30 s、68C 2 min,循环 35 次，68 C延伸 7 min,然后转入 4C。取 RT-PCR 产物5卩l,用1.5%琼脂糖凝胶电泳，根据Marker位置确认反应产物。 DNA序列测定和分析采用PCF扩增产物纯化后直接测序，委托上海博亚 生物科技有限公司完成测序工作。数据处理采用 DNASTARMEG等软件进行同 源性和进化分析。 结果 登革病