2.3 细胞冻存与复苏.pdf

第二章 动物细胞培养 第三节 细胞的冻存和复苏 细胞是不能长期在体外培养的，长期培养会有污染的风险，而且，长期培养 细胞也可能发生变异。所以，长期体外培养细胞不利于细胞保存的。那如何才能 长期保存细胞呢？通常，是将细胞冻存在液氮中。因为，液氮温度低达-196℃， 在液氮里，细胞的所有代谢基本处于停止状态，细胞能够长期保持稳定。细胞冻 存就是把细胞存储在液氮中保存细胞的过程。 用于细胞冻存用的设备主要有液氮罐冻存架 （图1），此外，还有有瓶口较 小的液氮运输罐，专门的液氮储存罐，细胞冻存罐中有专门放置细胞的冻存架， 方便放置细胞冻存盒和提取细胞。 液氮罐细胞罐 液氮罐贮存罐 液氮罐运输罐 冻存架 图 1 细胞冻存的主要设备 细胞需要怎样冻存到液氮中呢？如果我们把细胞直接放入液氮中是否可行 呢？答案是肯定不行。细胞不经任何处理放到液氮中，细胞 100%会死掉。因为 细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻时，细胞内的水分会很快形成冰晶，冰 晶的形成将导致细胞产生一系列不良反应：1）细胞因脱水而使局部电解质浓度 增高，pH 发生改变，部分蛋白质因此而变性。2）细胞膜上蛋白质、酶的变性， 3）会损伤溶酶体膜，释放的溶解酶可破坏细胞内结构成分。4）使线粒体肿胀、 功能丧失，导致细胞能量代谢障碍。5）细胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易 发生破坏，引起细胞膜通透性改变，使细胞内容物流失。6）细胞核内的 DNA 损 伤，因为冰晶形成导致体积膨胀，从而造成 DNA 空间构型发生不可逆的损伤性变 化，引起细胞死亡。 为了避免细胞在冻存时形成冰晶，细胞冻存需要加保护剂，保护剂本身必须 要满足：第一，对细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，第二， 可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，第三，缓慢冷冻方法可使细胞内的 水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损 伤。 细胞冻存常用的保护剂有甘油和二甲基亚砜（DMSO）。这两种保护剂都能满 足细胞冻存的需要。但 DMSO 在培养细胞中的保护作用效果要好于甘油。所以， 我们进行细胞冻存时多采用添加 10%的DMSO 冻存细胞。 细胞冻存及复苏的基本原则就是慢冻快融，这样可最大限度的减少冰晶的形 成。 细胞冻存的方法：第一步，取出细胞，首先在显微镜下观察细胞状态（视频）， 一般在细胞铺满瓶壁 70-80%、细胞活力最好的时候冻存细胞。如果细胞状态不 好，不要急于冻存。细胞状态不好的细胞很难复苏成活。 第二步，分离细胞：加入 PBS 缓冲液 3-5 ML，洗涤细胞 2 次，去除 PBS，加 入 0.25%的胰蛋白酶 1-2ML，消化细胞，不同细胞消化时间不同，可在显微镜下 观察，当细胞开始变圆，加入有血清的培养基，终止消化，细胞吸管吸取培养基 吹打细胞，让细胞全部从瓶壁分离下来，形成细胞悬液。 第三步，细胞计数，取细胞悬液 20ul，加入 60 uL 台盼蓝染液，混匀，取 10-15uL 到细胞计数板内计数细胞，计算细胞数目和活细胞比例，如果活细胞比 较不高不建议做细胞冻存。 第四步，离心/重悬 调整细胞密度，加冷冻保护剂：将细胞悬液稀释成 6 每毫升 2-5×10 ，加等体积冻存液，冻存液可以自己配制，用 20% DMSO 和 20% 血清配制冻存液，也有商用的细胞冻存液，直接使用。 第五步，分装：将细胞悬液按 0.5-1mL/份的量分装入 2 ML 的细胞冻存管中 将冻存管放入冻存盒内 （图2），（冻存盒里的冷冻液需保持室温）。