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凝胶层析法分离标准蛋白 （2 ） 1 实验背景 柱层析的基本操作  层析介质的选择与预处理  装柱  平衡  加样  洗脱  收集、鉴定和保存  介质的再生和保存 1 实验背景 层析介质的选择与预处理  Sephadex ：葡聚糖凝胶，G-10 、G-15等型号  Sephorose: ：琼脂糖凝胶，2B 、4B等型号  Sephacryl ：葡聚糖偶联丙烯基再与甲叉双丙烯酰胺聚合而成的 介质，有较高的硬度，能承受比普通凝胶更大的静水压力，有 S-100 、S-200等型号 1 实验背景  组分分离：将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在 分配系数上有显著差异，一般可选用Sephadex G-25和G-50  脱盐：对于小肽和低分子量 （1000~5000 ）的物质的脱盐可使用 Sephadex G-10和G-15  分级分离：目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离。 一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程 中这些物质都能不同程度地渗入到凝胶内部，由于K 不同，最后得 d 到分离 1 实验背景 凝胶的预处理  根据选择的层析柱估算出凝胶的用量。考虑到凝胶处理过程以及 实验过程的损失，凝胶用量在计算的基础上再增加10％~20％  在水中膨化干胶，不同类型的凝胶所需的膨化时间不同（从3小 时至几十小时不等）；如果加热煮沸，则膨化时间会大大缩短， 一般1~5小时即可  膨化处理后，对凝胶进行纯化和排除气泡 1 实验背景 装柱  组别分离时，大多采用2~30 cm长的层析柱，分级分离时一般 选用100 cm左右长的层析柱，直径一般为1~5 cm ① 将试剂瓶中凝胶倒入250 mL规格的烧杯，加适量洗脱液，搅拌 均匀，总体积约100 mL ② 将层析柱清洗干净，垂直固定在铁架台上。关闭层析柱出水口 （或连接到恒流泵上），向柱管内加入去离子水或缓冲液，检 查是否漏液，保留5 cm水柱。然后将薄浆状的凝胶悬浮液缓慢 地、连续地倾入柱中，使其自然沉降约2~3 cm高 1 实验背景 ③ 启动恒流泵，调节合适的流速（或用操作压调节流速，液面高度 差可设为30~40 cm ），使凝胶均匀沉降，并不断加入凝胶 ④ 重复上述操作，最后使柱中凝胶表面平坦并在表面上留有2~3 cm 高的缓冲液，同时凝胶表面不再下降，关闭出水口或关闭恒流泵 开关 1 实验背景 利用操作压装柱和平衡  操作压：层析柱内液面（A ）或贮液器（B）与出水口的高度差 （图片引自张龙翔等《生化实验方法和技术》，1997） 1 实验背景 装柱注意事项  预先检查层析柱和各接头是否漏气、漏液  柱子中不能有气泡  装柱要均匀  始终保持柱内液面高于凝胶表面，要防止液体流干  回收剩余凝胶 1 实验背景  层析柱的填装情况将直接影响分离效果，层析柱填装后用肉眼 观察应上下均匀、无纹路、无气泡  蓝色葡聚糖2000上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为，以检测 凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱 中的凝胶填装情况较好；如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱 1 实验背景 平衡 旋拧好层析柱的上端接头，上端接头的进口管插入洗脱液中， 平衡三个柱体积，流速要慢 1 实验背景 加样  加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少， 提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要 根据具体的实验要求而定  一般分离纯化蛋白质时，加样体积不超过凝胶柱床体积的5％  样品浓度大一些好，在不改变加样量的前提下减小加样体积的 方法是浓缩，但