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精品文档 人 T 细胞分离与体外培养实验方案 一． 实验目的 从人外周血中分离 PBMCs ，利用 CD3 和 CD3/CD28 免疫磁珠分离并扩增 T 细胞，用于慢病毒载体的感染。 二． 实验过程 6 1． 人外周血单个核细胞的分离 （每mL 外周血大约可获得 1×10 个单个核细胞） ⑴ 采血，稀释（外周血：稀释液 =1：1）； ⑵ 在离心管中加入人淋巴细胞分离液，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周 血（ Ficoll ：稀释血 =1 ：2 ）； ⑶ 20℃，440g，离心 20-30min ； ⑷ 离心后轻轻吸取中间白膜层，移入另一试管中； ⑸ 加入足量的稀释液充分洗涤， 400g，离心 5min ，弃上清； ⑹ 细胞沉淀加 1640 培养液重悬，即可用于 T 细胞的磁珠分选。 + 2 ． CD3 T 细胞分选 7 ⑴ 适量的 MACS 缓冲液洗涤 PBMCs （10 /mL ），300g，离心 10min，去上 清； 7 ⑵ MACS 缓冲液重悬 PBMCs （80 μL/10PBMCs ），加入 CD3 免疫磁珠 7 （20 μL/10PBMCs），混匀， 4 ℃孵育 15min； 7 ⑶ MACS 缓冲液（ 1-2mL/10 cells）洗涤细胞 1 次， 300g，离心 10min，弃 去上清； ⑷ 500 μL MACS缓冲液重悬细胞； ⑸ 将 MS 分离柱放置于磁力架上，加入 500 μL MACS buffer 预清洗分离柱； ⑹ 将⑷步得到的细胞悬液加入预先洗涤过的 MS 分离柱，先流出的细胞为 未标记的 CD3-T 细胞。 MACS 缓冲液洗涤分离柱 3 次； ⑺ 将分离柱从磁力架上取下，放入合适的管子内，加入 1mL MACS 缓冲液 至分离柱内，洗脱液即为 CD3+T 细胞，细胞计数后，用含 10%胎牛血清 的 RPMI1640 培养基重悬。 + 3 ． CD3 T 细胞的激活和扩增 . 精品文档 ⑴ CD3/CD28 免疫磁珠预先洗涤 ① 涡旋 30s 以上重悬 CD3/CD28 免疫磁珠； ② 取需要量的 CD3/CD28 免疫磁珠加至一个新的管中； ③ 加入与磁珠体积相等的缓冲液（至少 1mL），混匀（涡旋 5min 或者 颠倒混匀 5min ）； ④ 将管子置于磁力架上 1min，弃去上清液； ⑤ 将管子从磁力架上取下， 加入与第②步取出的磁珠体积相等的培养液 重悬 CD3/CD28 免疫磁珠。 + ⑵ CD3 T 细胞激活和扩大培