生物化学第一章 蛋白质——理化性质.pptVIP

氨基酸的Rf值 展开剂 正丁醇+吡啶+水 0.20 0.29 0.60 0.20 0.33 0.24 1 : 1 : 1 正丁醇+醋酸+水 0.23 0.23 0.70 0.28 0.22 0.11 12 : 3 : 5 天冬氨酸 甘氨酸 谷氨酸 丝氨酸 组氨酸 PC检测方法； 颜色, 显色(反应显色, I2蒸气, 紫外灯照) 剪下斑点，用适当的溶剂洗脱后测定(比色,荧光) 5.显色 为了显示层析斑点位置，可根据物质的性质不同，采用显色剂显示或紫外光显示。 (1) 显色剂显示： 被分离物质与显色剂生成有颜色的化合物，显示斑点位置。常用喷雾法 、浸渍法或涂刷法。 (2) 紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，如核苷酸类物质。有些物质受紫外光照射会发出荧光，如维生素B1、B2等，所以可在紫外光照射下观察到被分离物质的斑点。 6.定性分析 层析后的斑点显示出来后，计算出各斑点的Rf值，就可以对物质进行定性。 7.定量分析 对被分离的物质进行定量的方法很多，常用的有： (1) 剪洗比色法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱后，通过分光光度计进行比色定量。 (2) 直接比色法：用特制的分光光度计直接测量滤纸上斑点颜色的浓度，画出曲线，由曲线所包含的面积可求出待测物的含量。 (3) 面积测量法：实验证明，圆形或椭圆形斑点的面积与物质含量的对数成正比。所以，可用测量斑点面积的方法求得物质的含量。 （六） 常用电泳技术 1、醋酸纤维薄膜电泳 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳 3、琼脂糖电泳 (1)、聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （2）、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳原理 蛋白质是两性电解质，当pH＞pI时带负电荷，在电场中向正极移动；当pH＜pI时带正电荷，在电场中向负极移动；当pH=pI时净电荷为零，在电场中既不向正极也不向负极移动，此时的pH就是该蛋白质的等电点(pI)。各种蛋白质由不同的氨基酸以不同的比例组成，因而有不同的pI。利用pI不同，以PAG为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成pH梯度，蛋白质在凝胶中迁移至其pI的pH处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(isoelectric focusing,简释IEF)。 原理: 在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。 应用： 高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量 pH10 pH3 pI1= pH8 pI2= pH7 pI3= pH5 - + 线性梯度 SDS即十二烷基硫酸钠是阴离子去污剂，在水溶液中，以单体和分子团的混合形式存在，采取低离子强度，使单体浓度有所升高, 单体和蛋白质结合生成蛋白质-SDS复合物. 由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。 在蛋白质溶解液中，加入SDS和疏基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。SDS可使蛋白质的氢键、疏水键打开，还引起蛋白质构象的改变,形成近似雪茄形的长椭圆棒。不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同 ，约1.8nm，而长轴则与蛋白质的Mr成正比。 (七)、SDS原理 十二烷基磺酸钠 原态蛋白质 变性 ？ 磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区） 迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量 巯基乙醇破坏二硫键 目前，用SDS研究过的蛋白质已有数百种，均证实此法测定蛋白质Mr的可靠性。现在，市场有标准蛋白试剂出售。测定未知蛋白质Mr时，可选用相应的一组标准蛋白及适宜的凝胶浓度，同时进行SDS，则