5.2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 （共24张PPT）.pptVIP

【课堂小结】 * * 课题二多聚酶链式反应扩增DNA片段 专题五 DNA和蛋白质技术 多聚酶链式反应(PCR技术)， 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。 课题背景 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 胞内DNA复制的基本体系 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 脱氧 核糖 含氮碱基 磷酸 1 2 3 4 5 O ATGC 一、DNA的结构 1、DNA的基本单位： 脱氧核苷酸 DNA 分子的基本组成单位是 .共有 种,每个基本单位是由一分子的 、一分子的 、和一分子的 构成。 脱氧核甘酸 4 磷酸 碱基 脱氧核糖 1 2 5 4 3 磷酸基团（在 5 的位置上） 那么DNA分子的平面结构怎样呢？ 2、化学结构： P P P P P P P P 　　DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链（即一条链为3′→5′，另一条链为5′→3′）盘旋而成的规则双螺旋结构。 5 5 3 3 DNA起始端 3? 5? DNA聚合酶能不能从头开始DNA复制？ DNA聚合酶只能从3? 端延伸DNA链（合成子链）。因为DNA聚合酶只能将新的核苷酸加到已有的DNA双链上，所以DNA复制需要引物。 3? 5? 从中选出适合的引物进行PCR: (1)CCTAGA~~~ (2)GTTCGC~~~ (3)AAAGT~~~ (4)TTTCA~~~ 3? 5? 5? 3? DNA复制需要两种引物，引物Ⅰ，引物Ⅱ DNA复制的方向 引物 DNA母链 2、DNA的复制方向总是从子链的5’端向3’端延伸 1、DNA聚合酶从模板链3’端结合，从引物3’开始延伸DNA链 结论： 1、复制不是从头开始 2、需要两种引物，引物结合在母链的3端。 3、DNA聚合酶从引物3‘端开始延伸DNA链 4、子链DNA延伸的方向从5到3 1、 PCR（多聚酶链式反应）技术：体外模拟DNA复制的技术。 2、原理： 二、PCR原理 利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。 DNA双链 单链 变性（加热80-100℃ ） 复性（缓慢冷却） 重复30次 1 步骤：变性 —— 复性 —— 延伸 三 PCR的反应过程 90 ℃以上 50 ℃左右 72 ℃左右 2 体外PCR扩增DNA的条件： 模板： 原料： 酶： 2种引物： DNA的两条链 四种脱氧核苷酸 TaqDNA聚合酶 引物Ⅰ、引物Ⅱ 在一定的缓冲液中进行 严格控制温度 模板DNA 3? 3? 5? 5? 三 PCR的反应过程 5? 50℃ 引物1 引物2 5? 5? 3? 3? 5? 3? 3? 95℃ 三 PCR的反应过程 5? 引物1 引物2 5? 5? 3? 3? 5? 3? 3? 72℃ Taq酶 Taq酶 子链 子链 第1轮结束 第2轮开始 三 PCR的反应过程 第一轮 第二轮 第三轮 PCR技术的操作过程 循环数 变性 复性 延伸 预变性 94°C,10min － － 30次 ９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次 ９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 1、上一次循环的产物作为下一次循环模板 2、DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 PCR的反应过程总结： （2n） 细胞内DNA复制与体外PCR的技术区别： 细胞内复制 体外PCR技术 解旋 解旋酶、ATP作用下，部分解开 高温，全部解开，不需解旋酶 引物 2种 2种 DNA聚合酶 DNA聚合酶（细胞自身的，不耐高温） TaqDNA聚合酶（耐高温） 复制特点 半保留复制，边解旋边复制。 半保留复制，完全解旋后复制。 复制的方向 子链的5’端向 3’端延伸 子链的5’端向 3’端延伸 四 PCR反应的实验操作及操作提示 1、PCR仪 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 实质上一台能够自动调控温度的仪器 （一）理论上DNA扩增数目的计算 课题成果评价 1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n 2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n （二）实验中DNA含量的测定 1 、原理 可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在