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MTT法原理、步骤以及注意事项 MTT原 理 MTT全称为 3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3,5-di- phenytetrazoliumromide ，汉语化学名为 3-（4 ，5-二甲基噻唑 -2）-2 ， 5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒 体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 （Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO能溶解 细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处（也有用570nm波长的，我目 前用的都是570nm）测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范 围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子 的活性检测、 大规模的抗肿瘤药物筛选、 细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定 等。它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。 这不仅使工作量增加， 也会对实验结果的准确性产生影响， 而且溶解甲的有机溶 剂对实验者也有损害。 MTT 溶液的配制方法 通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取 MTT 0.5克，溶于100 ml 的磷酸缓冲液（PBS或无酚红的培养基中，用0.22卩m滤膜过滤以除去溶液里 的细菌，放4C避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包 住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝 对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好 在 0-0.7 范围内。 MTT一般最好现用现配，过滤后 4C避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml 保存在-20 度长期保存 ，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、 锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把 MTT粉分装在EP管里，用的时候现配， 直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不 能再用了。我自己操作一般是每次配制 15ml,过滤后4C避光保存，在两周内用 宀 完。 MTTt致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套?配成的MTT 需要无菌，MTT寸菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短， 或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉 ? 配制 MTT寸用 PBSph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl 8g + Kcl 0.2g + NazHPO 1.44g + KH2PQ 0.24g 调 pH 7.4,定容 1L。 普通MTT法实验步骤： 1:接种细胞：用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔 1000-10000 个细 胞接种到96孔板，每孔体积200ul. 2:培养细胞：同一般培养条件，培养 3-5天（可根据试验目的和要求决定培养 时间）。 3:呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4）20ul. 继续孵育4 h， 终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内 培养上清液。 每孔加150ul DMSQ脱色摇床振荡10min,使结晶物充分融解。 4:比色：选择490nm（570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值， 记录结果，以时间为 横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 药物MTT法实验步骤 贴壁细胞：（我的主要操作是贴壁细胞） 1:收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 100ul,铺板使待测细胞调密 度 1000- 10000孑L，（边缘孔用无菌PBS填充）。 2: 5%CQ, 37E孵育，至细胞贴壁，加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后 即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药? 一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔?建议设5个，否则难以反应真实情 况。 3: 5%CQ2, 37E孵育24-72小时，倒置显微镜下观察。 4:每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT，继续培养4h。若药物与MTT 能够反应， 可先离心后弃去培养液，小心用 PBS?中2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5:终止培养，小心吸去孔内培养液。 6:每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。 在酶联免 疫检测仪OD490n（ 570nm处测量各孔的吸光值。 7:同时设置调零孔即空白组（培养基、 MTT二甲基亚砜），对照孔（细胞、相 同浓度的药物溶解介 质、培养液、MTT二甲基亚砜）。 悬浮细胞： 1:收