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PITC柱前衍生高效液相法测定缩宫素氨基酸比值 .、八 、- 一. 刖言 目前，氨基酸检测主要应用氨基酸自动分析仪和 HPLC随着HPLC勺发展，使用HPLC技术 分析氨基酸获得迅速发展。HPLC已成为一种较为理想的检测氨基酸的方法。HPLC检测氨基 酸时，使用不同衍生剂反应后产生不同的衍生物，不同的衍生物所需色谱条件也有差别。 查阅相关的研究报告，所使用的衍生剂及色谱条件也不尽相同。每种方法各有自己的优缺 点，应根据所测样品的特性和仪器、试剂条件作出选择，最后选择异硫氰酸苯酯（ PITC） 柱前衍生法测定缩宫素氨基酸比值。 二?准备工作 主要设备和试剂 1.氨基酸分析专用柱（ 4.6 X 250，5um) 1 支 Agela 公司 2.咼效液相检测仪 1 台 安捷伦 3.十八种氨基酸 1 套 中检所 4.异硫氰酸苯酯 10 瓶 Agela 公司 5.三乙胺 2 瓶 Agela 公司 试剂配制 1.三乙胺乙腈溶液：取三乙胺 1瓶， 加乙腈 8.6ml，混匀。 异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯 1瓶，加乙腈2ml，混匀。4 C 3天 流动相A:称取三水醋酸钠25.3g （或无水醋酸钠15.2g ），加水1400ml，用冰醋酸调节 pH6.5，用水使成1860ml，再加乙腈140ml，使成2000ml，0.45um醋酸纤维膜过滤。 流动相B: 80汇腈，0.45um有机膜过滤。 氨基酸标准贮备液 中检所十八种氨基酸，105C 3小时。使用十万分子一天平。 天冬氨酸 约 32mg 133.10 谷氨酸 约 35 mg 147.13 甘氨酸 约 20 mg 75.07 脯氨酸 约 30 mg 115.13 酪氨酸 约 45 mg 181.09 胱氨酸 约 30 mg 240.30 异亮氨酸 约 30 mg 131.11 亮氨酸 约 35 mg 131.11 半胱氨酸是以胱氨酸折算成两份半胱氨酸进行计算。用 0.1mol/L盐酸溶解至250ml。 衍生方法 取标准品（样品）0.2ml，力卩100mmol/L异硫氰酸苯酯乙睛溶液 0.1ml，力卩1mol/L三乙胺 乙睛溶液0.1ml，混匀，室温放置1小时，加入0.4ml正己烷，振摇，放置10分钟，取下 层清液过滤后进样。 三?实验部分 色谱条件选择 1.1精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度。用 以下3个方法进行检测。从而确定最佳洗脱条件。 方法1 流速：1ml/mi n 检测波长：254nm 柱温：40C 进样体积：2ul 洗脱梯度： 时间 B% 0 0 4 3 16 11 17 21 d 32 34 34 100 38 100 38.01 0 45 0 方法2 流速：1ml/mi n 检测波长：254nm 柱温：40C 进样体积：2ul 洗脱梯度： 时间 B% 0 0 11 7 13.9 12 14.0 15 n 29.0 34 29.1 100 37.0 100 37.1 0 45.0 0 方法3 流速：1ml/mi n 检测波长：254nm 柱温：40C 进样体积：2ul 洗脱梯度： 时间 B% 0 0 4 0 31 25 [ 41 80 45 80 45.1 0 50 0 1.2根据实验结果，确定最佳洗脱条件后，更改进样量为 1ul。从而确定进样量的改变是 否影响检测。 1.3在 WS-10001-( HD-0903 -2002规定用0.02mol/L盐酸溶液，但是考虑到某些氨基酸 在0.02mol/L盐酸中不溶，所以改成0.1 mol/L盐酸溶液。为考察pH是否有影响，所以根 据先前实验结果，确定最佳洗脱条件后，进行以下实验。 精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度。 精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加2ml0.1mol/L盐酸溶液后加水至刻 度。 精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加水至刻度。 1.4 WS-10001-(HD-0903) -2002中规定使用外标法，但由于氨基酸分析过程比较复杂， 影响因素较多，而且取样量比较少。查阅欧美药典，发现氨基酸分析中采用内标法以减少 分析误差。 内标溶液1:称取a—氨基丁酸10mg加水溶解至250ml。 内标溶液2:称取正亮氨酸10mg加0.1mol/L盐酸溶解至100ml。 精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加5ml内标溶液1,再加5ml内标溶 液2,用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。(100pmol/L)进样一针。 精密量取4ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加5ml内标溶液1,再加5ml内标溶 液2,用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。(200pmol/L)进样一针。 检