cdna测序和表达谱研究.ppt

cDNA 末端快速扩增法 (RACE) 快速克隆全长 cDNA 方法的有效补充 原理： 利用 PCR 方法对 cDNA 所缺少的 5 或 3 端进行延伸和扩增。 设计与部分 cDNA 互补或一致的引物，在可能高表达的 cDNA 库中进行 5 或 3 端延伸、扩增。 组合后，可能获得全长 cDNA 。 ? 电脑克隆和 RACE 的方法并不能直接获得克隆，可能 有错误。 ? 必须进行高保真的 RT-PCR 扩增并亚克隆至质粒，再次 测序以验证克隆的正确。 全长 cDNA 在克隆过程中和克隆后，尤其重要。 互联网上可以利用的信息： 软件：比较基因组软件 COG ，基因组库 GDB 和遗传病 表型库 OMIM 等。 与核苷酸和蛋白质数据库进行同源性比较 : ① 可以提示所获顺序是否新基因，是否一个基因家 族的新成员，是否在生物进化过程中保守。 生物信息学分析 ② 利用结构功能域 (domain) 、基序 (motif) 及二级和三级结构 预测，可以提供新基因是否有功能相关的特殊结构，是否 分泌蛋白、受体、信号传导分子、酶及转录因子等有关信 息，为进一步研究提示方向。 ③ 电子组织表达谱是利用与新基因相匹配的 EST 来源，推测 新基因组织表达分布，具有一定意义。 ④ 利用 UniGene 和序列标志位点 (sequence tag site ， STS) 对新 基因进行染色体定位，为克隆疾病相关基因提供了资源。 二、基因表达谱 ( 一 ) 基因表达谱的概念 结构基因组：基因组的结构特征和序列信息。 但：人体细胞、组织，在不同的发育、分化阶段，不同的生理 条件和病理状态下，其表达的基因种类以及每一基因的表达 丰度都是各不相同的，且此差别存在严格调控的时空特异性。 生命过程的精确机制很大程度上正是基于基因的精细调控，许 多生命现象的深层次问题都集中于此。 基因表达谱 (gene expression profile) 概念： 通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性 cDNA 文库，大规模 cDNA 测序，收集 cDNA 序列片段，定性、定量 分析其 mRNA 群体组成，从而描绘该特定细胞或组织在特定 状态下的基因表达种类和丰度信息，这样编制成的数据表就 称为基因表达谱。 即： 特定状态； 分析所有的基因表达； 得到基因表达种类和丰度表。 表达谱的意义和作用 ① 从 mRNA 水平反映细胞或组织特异性表型和表达模式。 ② 如果收集各类组织和细胞的基因表达谱，将每一个表达的基 因标记到其表达的组织，就能组成一张人体基因图； ③ 对基因表达谱作两两或多重比较，就能筛选出细胞特异性或 发育阶段特异性的基因。 ④ 系统、全面地了解发育、分化、进化和衰老等基本生命现象， 以及肿瘤、心血管疾病等危害人类健康的重大疾病发生机制 的认识。 大规模基因表达检测技术 ① 微阵列法 (microarray) ② DNA 芯片 ③ SAGF(serial analysis of gene expression) 。 优点：定性、定量、大规模地检测基因的表 达产物 mRNA ，并绘制基因表达谱。 ( 二 ) 基因表达谱的编制 1 ．文库的构建及其特殊要求 建库方法不同直接影响到获得的序列适合于什么样的分析。 cDNA 文库分两大类。 ① 为综览人体全部基因种类而设计，以发现新基因为目的。 如：去除高丰度表达基因 mRNA 后建立而成的“ 均 一化” (normalized) 文库； 为增加文库组成的复杂性，将许多来源于不同组织的亚文库 混合在一起形成的混合文库。 两个缺陷： A. 插入片段全长常常缺乏 5 端序列，尤其是 mRNA 长度 2kb 者。若从 5 端测序，获得的 EST 并不与基因有一对 一的对应关系。 EST 可以来源于两条基因，也可以来源 于一条基因的不同区段； B. 没有考虑到由于 mRNA 的大小和碱基组成差异对克隆效 率的影响，从而使文库组成产生“偏性”，不能真实地 代表原始 mRNA 群体的基因组成。 因此，该类文库收集到的序列不适于作 mRNA 的定量分析。 ② 3 端方向的 cDNA 文库，专为编制基因表达谱而设计，以定性、 定量分析细胞或组织的 mRNA 群体为目的。 采用两个办法： A. “ 缩短”策略 (shorten strategy) ，即用内切酶