2021课题3血红蛋白的提取和分离.ppt

血红蛋白的提取与分离 基础知识 1. 分离生物大分子的基本思路： 选用一定的 物理或化学 的方法分离具有不同物 理或化学性质的 生物大分子 。 2. 蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质 各种特性 的差异，如 分子的形状和 大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质 和对其他分子的亲和力 等等，可以用来分离 不同种 类 的蛋白质。 凝胶色谱法 3 、提取分离方法 凝胶电泳法 ( 一 ) 凝胶色谱法 根据 相对分子质量的大小 分离蛋白质的有效方法 1 、原理： 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 2 、材料 - 凝胶 多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 4. 凝胶色谱法 分离蛋白质 的原理和 具体过程 基础知识 （二）缓冲溶液 1. 概念 : 在一定的范围内，凡是能够抵制 外加少量强 酸或强碱 的影响使原来溶液 PH 值基本保持 不变 的混合溶液。 2. 作用 : 能够抵制外界的酸和碱对溶液 PH 值的影 响，维持 PH 基本不变 。 基础知识 （二）缓冲溶液 3. 缓冲溶液的配制 : 通常由 1 － 2 种缓冲剂 溶解于水中配制而成。 调节缓冲剂的 使用比例 就可以制得在 不同 PH 范 围内 使用的缓冲液。 磷酸缓冲液 4. 在本课题中使用的缓冲液是 :____ , 其目的是 : 利用缓冲液模拟细胞内的 PH 环境，保证血红 蛋白的 正常结构和功能 ，便于观察 ( 红色 ) 和科 学研究 ( 活性 ) （三） 电泳： 基础知识 1. 概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2. 原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等 都具有可解离的基团，在一定的 PH 下，这些基 团会带上正电或负电。 ②在电场的作用下，这些 带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ③电泳利用了待分离样品中各种分子 带电性质 的 差异以及 分子本身的大小，形状 的不同，使带电 分子产生不同的 迁移速度 ，从而实现样品中各种 分子的分离 。 影响蛋白质分子运动速度的因素 决定 运动方向 电荷性质 电荷量 形成 库仑力 形成 阻力 决定 运动速率 √ √ √ √ √ √ √ 分子形状 分子大小 3. 类型 : 琼脂糖 凝胶电泳、 聚丙稀酰胺 凝胶电泳。 琼脂糖凝胶电泳示意图 在 电场 的作用下， 这 些 带电 分子 会 向着 与 其所 带 电 荷相反的 电极 移 动 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 、测定蛋白质分子量 : 常用 十二烷基硫酸钠 （ SDS ） — 聚丙烯酰胺 凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由 单体丙烯酰胺 和 交联剂 N,N - 亚甲基双丙烯酰胺 在 引发剂 和 催化剂 的作 用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。 丙烯酰胺和交联剂 N,N - 亚甲基双丙烯酰胺（形成交联） N,N - 亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 2. 原理： 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的 迁移率 取于它 所带 净电荷的多少 以及 分子的大小 等因素。 3. SDS 作用机理 : SDS 能使 蛋白质发生完全变性。解聚成单 条肽链 ，因此测定的结果只是 单条肽链的分 子量 。 SDS 能与各种蛋白质形成 蛋白质 — SDS 复合物 ， SDS 所带负电荷的量大大超过 了蛋白质分子 原有的电荷量 。因而 掩盖了不 同种蛋白质间的电荷差别， 使 电泳迁移率完 全取决于分子的大小。 电泳检测结果 琼脂糖凝胶电泳 实验操作 （一）蛋白质提取和分离步骤 样品处理→粗分离 → 纯化 → 纯度鉴定 （二）操作过程 1. 样品处理： 可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血 液来分离血红蛋白。 1. 提问： 用鸡的红细胞提取 DNA ，用猪、牛、羊的 红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有 DNA ，便于进行 DNA 的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血 红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。 2. 提问： 血液有哪些成分？ 血浆 水 分 血 液 固体物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等 白细胞 两个α－肽链 血细胞 血小板 红细胞 血红蛋白 两个β一肽链 （最多） （ 90 ％） 四个亚铁血红素基团 血红蛋白的特点： 血红蛋白 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁 血 红素基团 每个肽链环绕一个 亚铁血红素基团， 此基团可携带 一分子 O 2 或一分子 CO 2 ， 红细胞的洗涤 红细胞的洗涤 : ①目的 : 去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化 . ②操作： 1 、采集血样 2 、低速短时间离心 （速度越高和时间越长，会使白细 胞等一同沉淀，达不到分离的效果） 3 、吸取血浆： 上层透明的黄色血浆。 4 、盐水洗涤： 下层暗红色的红细胞 + 五倍体积的 0.9 ％ 的 NaCl 溶液