流式细胞术(免疫学) .ppt

外周血淋巴细胞样品的制备 分离单个核细胞 培养细胞的样品制备 蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤 单细胞悬液 免疫检测样品制备 * ppt课件 新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法 保证细胞数量：105-106 * ppt课件 抗体使用原则 根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体 低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如PE 高表达的，FITC适用 荧光免疫标记方法 直接法（多用） 间接法 * ppt课件 抗体标记的方法 * ppt课件 如何选择流式细胞仪测荧光染料 ???依据FCM的激光光源发射光波长做为重点考虑。 如：氩离子气体激光管,它的发射光波488 nm； ????????氦氖离子气体激光管发射光波长633 nm； ??????????????? ?488 nm激光光源常用的荧光染料有 FITC ??????????????? PE ??????????????? PI ????????????????CY5 ??????????????? preCP ??????????????? ECD等。 * ppt课件 ? 激发光波长（ηm） 发射光峰值（ηm） FITC 488 525（绿） PE 488 575（橙红） PI 488 630（橙红） ECD 488 610（红） CY5 488 675（深红） PreCP 488 675（深红） * ppt课件 2.数据收集 参数：即每一种测量信号 参数种类： 两个散射光参数：FS和SS 通常三种荧光参数：绿、橙、红 * ppt课件 Gate设置：选定散点图中的指定一个区域，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群对其参数进行分析。 设门分析技术( gating analysis ) 门的形状：线性门、矩形门、圆形门、多边形门、十字门、任意形状门。 * ppt课件 * ppt课件 数据显示方式 单参数测量数据的显示和分析； 双参数测量数据的显示和分析； 多参数测量数据的显示和分析。 * ppt课件 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 （一）单参数直方图 * ppt课件 细胞相对数量 信道(channel ) 单参数直方图 * ppt课件 单参数直方图（Histogram） X轴：荧光信号的强度，用“通道数”表示. Y轴：具有相同光信号特征性细胞的频率 * ppt课件 线性放大 对数放大 通道数可用线性或对数显示。 * ppt课件 双参数直方图： 纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞的相关信息。 （二）双参数直方图 散点图 二维等高图、等密度图、假三维立体图 * ppt课件 1.双参数直方图点图 SS FS * ppt课件 ppt课件 第15章 流式细胞术 1. 工作原理 2. 技术要点 3. 临床应用 * ppt课件 概念 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） 是一种利用流式细胞仪对生物细胞的理化特性和生物学特性进行多参数定量分析，和对特定细胞群体分选的技术。 流式细胞仪 集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、免疫学技术为一体的一种新型高科技仪器。 * ppt课件 第一节 流式细胞术的基本原理 * ppt课件 流式细胞仪特点 单细胞悬液或生物颗粒 快速 多参数 精度高 当代最先进的细胞定量分析技术 * ppt课件 流式细胞仪主要组成部分 流动室与液流驱动系统（Z） 激发光与光束成形系统（X） 细胞信号检测与分析处理系统（Y） Z X Y * ppt课件 X * ppt课件 X--激发光源 单波长、高强度、高稳定性 多采用氩离子（488nm）激光器或氦氖（633）激光器 一般选配2-4根激光，488nm、633nm和355nm、407nmUV激光 最多检测13个荧光参数 * ppt课件 * ppt课件 Beam shaping lens reflector 光束成形系统：两块相互垂直放置的柱面透镜对激光束进行聚焦，形成