红芸豆红细胞凝集素单体的分离纯化和性质研究(一).docx

红芸豆红细胞凝集素单体的分离纯化和性质研究 红芸豆红细胞凝集素单体的分离纯化和性质研究 （一 ） 【摘要】目的研究一种从红芸豆中提取红细胞凝集素单体 （PHA-E）的新方法。方法红芸豆经 过浸提，离子交换树脂分离，分子筛层析纯化后得到 PHA-E样品。采用电泳法测定其纯度、 分子量和等电点。用 2%人细胞悬液测定样品凝集红细胞的能力和影响凝血的因素，使用硫 酸苯酚法测定其糖含量。结果经PAGE分析PHA-E样品为单带电泳纯，SDS-PAG上显示亚基 分子量为32kD，等电点为6.5.样品使人红细胞50%凝集的蛋白质最低浓度为 4卩g/ml左右。 单糖不影响PHA-E凝血活力，EDTA抑制其凝血活力，Zn2+促进其凝血。糖含量为 8.1%. 【关键词】红细胞凝集素分离纯化凝血性质研究 Abstract ： ObjectiveTostudyanewmethodforErythrohemagglutinin （ PHA-E ） productionfromPhaseolusvulgaris.MethodsPHA-EwaspurifiedfromtheexcellentseedsofPhaseolusv ulgarisbyextraction ， ionexchangechromatographyandfinalgelfiltrationchromatography.Thepurity,themolecularweighta ndtheisoelectricpointofpurifiedPHA-Eweredeterminedbyelectrophoresis.Theabilityandtheinfluenc ingfactorofagglutinationweredeterminedby2%erythrocytesofhuman.ConclusionThepurifiedPHA-E wassinglePAGEoutlineandhadapparentsubunitmolecularweightsof32kDbySDS-polyacrylamidegele lectrophoresis.IsoelectricpointofthePHA-Ewas6.5.PHA-Ecanpromoteagglutinationofhumanerythro cytesat4 卩 g/ml,butitsactivitywasnotinhibitedbyanymonosaccharide.EDTAcaninhibittheabilityofagg lutination,andZn2+canaccelerateit.ThesugarcontentofPHA-Ewas8.1%. Keywords:erythrohemagglutinin ；separationandpurification ；haemagglutination ；characterization 植物凝集素（PhytohemagglutininPHA）是从豆科植物种子中提取的一种含糖蛋白质〔 1〕。植物 凝集素具有刺激外周血淋巴细胞 RNA合成和有丝分裂〔2〕，促进免疫反应，使细胞凝聚， 肿瘤细胞失活，以及诱发人外周血淋巴细胞产生抗癌淋巴因子等生物学活性。文献〔 3〕报 道PHA是由E、L两种亚基组成的四聚体蛋白质的混合物，按其亚基组成可分为 L4、L3E、 L2E2、LE3 E4具有相同物化性质和不同生物学活性的同工凝集素。其中 PHA-E含有4个相 同的E亚基，具有最强的红细胞凝集功能， 没有白细胞凝集能力。 由于凝集素单体较混合物 PHA对于糖链具有更加特异的识别能力， 可以作为分子探针，研究特异细胞膜受体的分布等， 在免疫学、肿瘤、生殖生理、细胞生物学等许多方面得到应用，在医学、农业上呈现出巨大 的应用前景。 关于红细胞凝集素单体的分离纯化国内还未见报道， 本研究改进和优化前人的 提取和纯化方法， 简化操作程序， 从红芸豆中得到了凝血活力较高的电泳纯红细胞凝集素单 体。 1 材料与方法 1.1 仪器与试药 UV1 1 02紫外－可见分光光度计 （上海天美科技有限公司） ，蛋白质纯化系统 （上海琪特仪器 分析有限公司），高速冷冻离心机（Eppendorf公司），MINI-PROTEINW电泳系统（Bio-Rad公 司）。 红芸豆 （购自甘肃兰州） ，低分子量蛋白标准（上海东风生物技术有限公司） ，蛋白质等电点 标准（Pharmacia公司），两性电解质（pH3?9, Pharmacia公司），PHA-E （Sigma公司）， DEAE-SepharoseFF、 CM-SepharoseFF、 SephadexG100 （Pharmarica 公司），乙酰氨基葡萄糖 （ Sigma 公司），人