RTPCR实验步骤及注意项目.docVIP

RT-PCR试验 时间:-01-05?22:32 起源: .com 作者:生物界 ? RT-PCR试验有三步：抽提RNA，RT，PCR。??要求： 1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有部分要求，常见500ng或1ug。 2. RT按要求做，通常不会出太大问题。??3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能处理。 1）RT和PCR时引物设计是不是一定要先知道目标基因序列？必需??在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异下游引物。假如用a和b方法，是扩增全部cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 模板继续扩增。??假如用c方法，那么要去那里查它序列呢？ 问题：??在做RT-PCR碰到一怪现象，即对同一动物不一样组织扩增同一段基因，结果从一个组织中能够扩出我目标基因，条带很好，而另一组织在一样条件下却得到很多非特异性条带，尝试其它条件一样无法得到满意结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中全部表示，且内参考在两种组织全部可扩增出来）??从这两种组织中提取RNA量是不一样，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这相关呢？ 请高手指教！??解答：??1.RT-PCR有两种做法：??条件含有话可用kit进行一步法进行；若条件不太好话可分两步进行逆转录再PCR。但以后发觉两步法结果愈加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系愈加单一比较利于PCR进行，当然也可能是我买kit不太好。（promega）。??2.RT-PCR应含有条件??高质量RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物（最好产物短点）；若包含粗略定量话还应考虑RNA浓度或是cDNA浓度（假如由内标分子愈加好，但我发觉其实很不轻易将RNA浓度和内标分子表示量调整完全一样）；体系均一性等。??3.RACE??我做过RACE（3’RACE是宝生物Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来，其中一个已经取得了全序列（RACE方法），而另一个基因3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因3‘UTR太长缘故，我全部快绿了，有没有 RT-PCR常见内标b－actin 和GAPDH使用有选择性吗？比如不一样细胞，不一样刺激。 相关内参： RT-PCR内参考能够在一个管子里做（那样也是图好看部分），最好分开两管，把除了引物之外mixture统一配，拍照后，算目标基因和内参比值，这就是基因表示相对浓度。??问：我曾经作过同一管PCR，内有actin 和目标基因引物。即使可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。请教mxbdna ，你是怎样处理同一管PCR各成份浓度？ 答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using accurate piptte is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime. 在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶原来就是过量^-^，（平时做pcr时候，完全能够再省部分taq酶，半斤八两就能够了，我想这肯定再很多贴子里应该全部谈到了。Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。??关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）即使用不着，不过摸上3、5摸总是必需，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸好了，还要考虑比较不一样模板中量，所以我们不提议再同一管中进行，因为还有相互竞争抑制问题，即使不一样基因之间。??相关内参提议： 一定要做内参，每一次，我想。不作内参结果是不可信??电泳能够不一起跑，没相关系，计算是相对表示程度，着我在好几封帖子里全部谈了，再说一边我得见解，1、半定量和定量RT-PCR做全部是基因相对表示量，不是绝对表示量，除非你能正确知道来自多少细胞，不过细胞