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猪流行性腹泻病毒血清学与抑制病毒入侵细胞的研究 猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) 是急性、高度 传染性猪流行性腹泻 (Porcine epidemic diarrhea,PED) 的致病原 , 可感染所有日 龄的猪 , 并在哺乳仔猪中引起较高的死亡率。 本研究主要对 PEDV编码的结构或非 结构蛋白进行表达纯化 , 并以此为检测抗原建立敏感有效的血清学检测方法 , 对 感染或免疫 PEDV后不同日龄猪体内的抗体消长规律进行监测 ; 同时以制备的抗 PEDV的单抗为基础 , 对 PEDV入侵机制进行初步研究。 根据 PEDV G2毒株 (GenBank accession no.KU558701) 基因序列设计特异性 引物 , 以其 cDNA为模板分别扩增 PEDVS1、E、ORF3C、非结构蛋白 nsp1、nsp2 以 及 nsp3 中 Ac(Acidic domain) 、ADRP(ADP-ribose-1-monophosphatase domain) 功能域 , 克隆到真核或原核表达载体中 , 构建重组表达质粒 , 利用真核或原核表达 系统表达相应蛋白 , 并进行层析纯化 , 经 SDS检测、 Westernblot 鉴定正确 后 , 作为免疫原 , 免疫新西兰大白兔 , 制备相应的兔抗 PEDV多克隆抗体 ;Western blot 和 IFA 鉴定获得的抗体有较好的反应性和特异性 ,ELISA 检测其效价均达到 1:100000 以上 , 可满足后期试验需要。用 PEDVG2毒株感染 Vero 细胞 , 扩增病毒。 蔗糖密度梯度离心纯化 PEDV细胞毒 , 制备纯化的 PEDV全病毒颗粒 ; 同时分别 以前期制备的 PEDVS1蛋白、ORF3C蛋白和 E 蛋白作为检测抗原 , 方阵滴定法确定 PEDV纯化全病毒颗粒、 S1 蛋白、 ORF3C蛋白和 E 蛋白的最佳抗原包被浓度分别 5 μ g/mL、4.4 ng/mL、 15.6 ng/mL、7.8 ng/mL; 最佳一抗稀释度均为 1:100, 最佳二抗稀释度为 1:10000; 并对抗原包被条件、抗体作用时间、孵育温度等条 件进行优化 , 最终分别建立以 PEDV全病毒和 S1 蛋白为抗原的间接 ELISA 方法检 测临床样本中抗 PEDV IgG和 IgA 抗体 , 以 PEDV ORF3C和 E 蛋白为抗原的间接 ELISA 方法检测样本中抗 PEDVIgG抗体。用上述方法检测国内不同猪场中有腹泻 症状的不同年龄段的猪初乳、奶、血清、粪便等不同样本中抗 PEDV抗体的存在 情况 ; 结果显示 , 所检样本中普遍存在抗 PEDV抗体 ; 相比之下 , 母猪中抗 PEDV抗体 水平较高 ,0-1W 龄中也存在较高水平的抗 PEDV抗体 , 但在 3W龄猪中抗体水平开 始下降 ,7W 龄时抗体水平有所上升 ,13W 和 20W龄时抗体水平基本不变 ; 这与当前 不同年龄段猪感染 PEDV的情况基本相符。 同时 , 本研究对部分猪血清中抗 PEDV中和抗体进行随机抽检 , 结果表明 , 抗 PEDV抗体水平高的样本中的中和抗体水平也较高 , 即本研究所建立的 ELISA检测 方法与中和试验检测结果基本一致 , 有较高的可信度。用上述间接 ELISA 方法和 Western blot 、IFA(Immunofluorescence) 检测 PEDV全病毒颗粒、PEDVS1、ORF3、 E 及 nsp1、nsp2、nsp3-Ac 和 nsp3-ADRP 蛋白与临床 PEDV感染猪血清样品中抗 PEDV抗体的反应性 . 结果显示 , 虽然 S1和 Ac 蛋白在 IFA 检测中均出现特异性荧 , 但在 Western blot 检测中 ,S1 蛋白的敏感度和特异性更高。 951 份感染状态未知的猪血清的 ELISA检测结果显示 , 上述 PEDV蛋白均有一定反应性。而 PEDV S1、 ORF3C、E 蛋白和 PEDV全病毒纯化抗原检测均显示出相似的抗体消长趋势 , 且抗 PEDVIgG抗体均在 1 周龄仔猪中最早出现。 同时 , 对 30 份未感染 PEDV的仔猪阴性血清检测显示 , 上述所有蛋白作为检测抗原均未出现反应 ; 即本研究制备的检测抗原均有高度特异性。 综上所述 ,PEDVS1 蛋白可作为 PEDV感染检测的最佳血清学诊断抗原。 PEDV S1蛋白为免疫原 , 免疫 6-8 周龄 BABL/C小鼠 , 按照传统杂交瘤细胞技术制备抗 PEDVS1单克隆抗体 ; 最终获得 4 株稳定分泌抗 PEDVS1 蛋白的单克隆 抗体的杂交瘤细胞株 , 分别命名为 2C2G11、