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牦牛胰脏中糜蛋白酶的分离纯化及部分特性研究 糜蛋白酶是一种来源于脊椎动物的消化酶， 在治疗消炎和抗癌方面具有良好 的药用价值。本研究以青海大通牦牛胰脏为原料， 采用单因素试验和响应面分析 Box-Behnken 试验方法对缓冲液浸提、 超声波萃取、ChTRP活化工艺进行优化，获得糜蛋白酶提取的最佳工艺参数； 并通过单因素试验对 PVS精提工艺进行优化，进一步提高其酶活，同时对纯化后的酶采用 SDS及分子量的鉴定；最后对鉴定的酶进行部分特性的研究。 主要研究结果如下： (1) 提取剂筛选：选取五种不同的提取剂浸提牦牛胰脏组织匀浆，通过单因素试验优化得到以 0.002mol/LTris-HCl 作为浸提缓冲液的浸提效果最佳时，酶活力为 106.5U/mL，是以异丙醇和水浸提所得酶活力的 2 倍。 浸提工艺单因素优化： 选取不同的 Tris-HCl 缓冲液浓度、肉样与缓冲液体积比和浸提温度进行单因素试验，得到最佳 Tris-HCl 缓冲液浓度为 3mmol/L，其 酶活为 187.9U/mL，最佳肉样与缓冲液体积比为 1:3 ，其酶活为 180.5U/mL，最 佳浸提温度为 5℃，其酶活为 190.5U/mL。 浸提工艺 Box-Behnken 响应面优化：显著影响酶活力的因素主次顺序为：浸提缓冲液浓度＞浸提温度＞肉样与缓冲液体积比， 且影响均呈正效应。 最佳缓冲液浸提工艺为：浸提缓冲液浓度为 4.0mmol/L 、缓冲液与肉样体积比为 3.0 、 浸提温度为 5℃。 在此最优工艺条件下，牦牛胰脏中糜蛋白酶活力为 203.7U/mL。(4) 超声波 萃取工艺单因素优化：选取不同萃取功率、萃取时间和萃取温度进行单因素试验， 得到最佳萃取功率为 700W，其酶活为 216.6U/mL，最佳萃取时间为 6min，其酶 活为 184.8U/mL，最佳萃取温度为 5℃，其酶活为 160.7U/mL。 超声波萃取工艺 Box-Behnken 响应面优化：显著影响酶活力的因素主次顺序为：萃取温度＞萃取功率＞萃取时间， 且影响均呈正效应。 筛选出最佳工艺参数：超声波萃取功率为 755W、萃取时间为 7.5min 、萃取温度为 4℃时，其酶活力为 216.3U/mL。 ChTRP活化工艺单因素优化：选取不同 pH 值、 Trypsin 添加量、活化时间和温度进行单因素试验，得到最佳 pH值为 8，其酶活为 184.5U/mL，最佳 Trypsin 添加量为 0.4mg，其酶活为 187.9U/mL，最佳活化时间为 120min，其酶 活为 202.8U/mL，最佳温度为 25℃，其酶活为 194.2U/mL。(7) ChTRP 活化工艺 Box-Behnken 响应面优化： 显著影响酶活力的因素为 pH 值、Trypsin 添加量、活 化时间和温度，其影响大小依次为：活化时间、 pH值、温度、 Trypsin 添加量。 并通过 Box-Behnken 响应面试验，以糜蛋白酶活力为指标， 筛选出最佳工艺 参数 pH 值为 7.4 、Trypsin 添加量为 0.4mg、活化时间为 125.9min 、温度为 32℃ 时，其酶活力为 221.76U/mL。(8) PVS精提：在 25℃时，当 PVS浓度为 0.015mol/L 对糜蛋白酶聚合效果最强； 当 PEI 浓度为 4.E-06mol/L 时，糜蛋白酶聚合物的溶 解效果最佳，酶活力达到 592.4U/mL，提取率为 14.95%。 SDS鉴定纯度达到电泳纯，分子量约为 25ku。酶学特性：最适反应 pH 值为 8.0 ，在 pH值 7.5 ～ 9.0 、18～ 38℃的条件下糜蛋白酶稳定性最高；金属离 Ca2+、Cu2+、Mn2+、K+、Fe3+、Fe2+、Zn2+对该酶均有不同程度的抑制作用，其抑制率达到 0.4%～14%； Km=0.57mmol/L， Vmax=0.0055μmol/min 。 综上所述，采用缓冲液浸提、超声波萃取、 ChTRP活化、 PVS聚合纯化技术从牦牛胰脏中将糜蛋白酶分离纯化至电泳纯， 该酶具有耐酸耐热性， 可被金属离 子抑制。本研究具有工艺简单、生产周期短、所制的糜蛋白酶质量高等特点，因 此，利用先进的生物分离工程技术进行糜蛋白酶的生产，提高酶的收率及活力， 在生化制药业中以及动物副产品综合利用中具有积极的意义。