第3章蛋白质的通性、纯化和表征详解.pptVIP

2021/2/6 * （四） 亲和层析 亲和层析:利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力,建立起来的一种有效的纯化方法。 配基:酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物,激素与受体蛋白,抗原与抗体等。 亲和层析的原理: 亲和层析的原理 五、蛋白质相对分子质量的测定 1、 凝胶过滤法测定相对分子质量 凝胶过滤所用介质为凝胶珠或称为凝胶颗粒,其内部为多孔网状结构 凝胶颗粒中具有大量微孔,这些微孔只允许较小的分子进入凝胶颗粒内部,而大于胶粒微孔的分子则被排阻在外 洗脱时大分子随洗脱液先流下来,洗脱液体积小;小分子在颗粒网状结构中穿来穿去,历程长,后洗脱下来,洗脱体积大 测定蛋白质分子量一般用交联葡聚糖作为凝胶,商品名:Sephadex 测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕 以相对分子质量对数（logM）对Ve作图,得标准曲线 再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量 2021/2/6 * 2. SDS—PAGE （十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳） 用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理 蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合,形成SDS-蛋白质 复合物 用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的相对迁移率作图 测出待测样品的相对迁移率 从标准曲线上查出样品的相对分子质量 2021/2/6 * ★影响迁移率的主要因素 凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会 产 生不同的阻力〔主要因素〕 凝胶的浓度和交联度 同一电泳条件下,分子小,受阻小,游动快,迁移率大。相对分子质量大者,迁移率小 ★ 优点:快速,样品用量少,可同时测几个样品 缺点:误差大,约为±10％（误差主要来源于迁移距离的测量误差） ★ 此方法只能测得 亚基肽链的相对分子质量 2021/2/6 * 2021/2/6 * 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 总蛋白含量分析:凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法 考马斯亮蓝法（Bradford法）:考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料,在酸性条件下可与Pr上的正电荷结合,形成蓝色化物,在595nm具有特定吸收。 紫外吸收法: 由于核酸在260nm具有光吸收,对测定干扰较大,可采用280nm、260nm同测法。 蛋白质浓度mg/ml＝1.45A280-0.74A260  （一）蛋白质含量测定 2021/2/6 * 特定蛋白组分的含量分析: 酶和激素等:酶活性或激素活性表示（比活性） 其它蛋白:抗原抗体反应(western blot) 2021/2/6 * （二）蛋白质纯度鉴定（均一性） 基本手段: ①电泳分析: 单条带 ②沉降分析: 单一的沉降速度 ③溶解度分析: 溶解度曲线只呈现一个折点 ④ N端测定:均一的单链蛋白质N端残基只可能有一种氨基酸。 * 2021/2/6 * 第3章 蛋白质的通性、纯化和表征 2021/2/6 * 一、?蛋白质的酸碱性质和等电点 蛋白质与多肽一样,能够发生两性离解,也有等电点。 等电点:蛋白质所带净电荷为零的pH值称为等电点。 在等电点时,蛋白质在电场中不移动,溶解度最小,粘度最大。可以用溶解度法,聚焦电泳法等测定等电点。 2021/2/6 * 二、?蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 蛋白质分子直径在1-100nm之间,在水溶液中具有胶体溶液的通性。 1、?稳定蛋白质胶体溶液的主要因素: ①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开,不会互相碰撞凝聚而沉淀; ②两性电解质非等电状态时,带同种电荷,构成稳定的双电层,互相排斥不致聚集沉淀。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜,因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 一旦电荷被中和或水化膜被破坏,蛋白质颗粒聚集,便从溶液中析出沉淀。 2、??沉淀蛋白质的方法 ①盐析法: 大量的中性盐（（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl）,使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀;不引起变性。 ②有机溶剂沉淀法: 破坏水化膜,降低介电常数,丙酮、乙醇等; ③重金属盐沉淀:pH＞pI时,蛋白质颗粒带负电荷,与重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀; ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法:pH小于pI时,蛋白质带正电荷,易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂:单宁酸、苦味酸、钨酸。酸类:三氯乙酸、磺基水杨酸; ⑤加热变性沉淀法。 2021/2/6 * 三、蛋白质分离纯化的一般原则 纯化的实质:增加制品的纯度或比活性 一般程序:前处理、粗分级分离、细分级分离、结晶保存 电泳 前处理 粗分离 细分离 生物组织 无细胞