生物分离工程-第二章-初处理-沉淀及泡沫分离.pptVIP

2021/2/6 * 2.3 泡沫分离因素 A．待分离物质的种类 B．溶液的pH值 溶液的pH值对分离效果有很大的影响,等电点好。 d . 表面活性剂浓度 表面活性剂的浓度不宜超过临界胶束浓度,但也不能太低,使泡沫层不稳定,太高则使分离效率下降。 D．温度 首先温度应达到表面活性剂的起泡温度,保持泡沫的稳定性,其次根据吸附平衡的类型来选择温度的高低。 E．气流速度(过大泡沫不容易卸料,成乳化气体,过小蛋白容易界面失活而变性;过大时候间隙液多,产品浓度低） C．溶液离子强度 此外,泡沫的性质、层高、排沫方式、搅拌等也是影响泡沫分离的因素 * * * * * 2021/2/6 * 优点: 无机酸通常价格便宜,无毒 无后续脱盐步骤 可与其它沉淀方法同时用 缺点: 蛋白质对低pH 敏感,易失活 等电点沉淀法适用范围 2021/2/6 * 机理: a 介电常数（介电系数越低,蛋白间正负电荷吸引作用力越大） b 溶剂化（蛋白质结合水被取代） c 疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团 结合形成疏水层 优缺点: 优点是:密度低,容易沉降;不用脱盐;溶剂容易除去并可以回收。 缺点是易使酶变性（破坏蛋白内部次级键）;溶剂易燃;消耗多不经济;低温下才能操作。 1.3.3有机溶剂沉淀法 ?F?＝?（1/4πε)q1q2/r2 ε=1-εr 由于水是偶极分子,介电系数εr大 （水分子由外部电场诱导形成内电场抵消外部电场） 2021/2/6 * 常用的有机溶剂沉析剂 选择依据:不会对蛋白产生变性;溶解度高;介电系数小;毒性小,容易回收 乙醇:沉析作用强,挥发性适中,无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析; 丙酮:沉析作用更强,用量省,但毒性大,应用范围不广; 特点: 介电常数小,60%乙醇的介电常数是48 丙酮的介电常数是22 容易获取 2021/2/6 * 影响因素及控制 A、[乙醇]:通常随[乙醇]上升,protein溶解度下降。过多加入乙醇也可能导致样品变性。 B、[pro]:避免使用很稀的浓度,以免使用大量乙醇。一般认为,对于蛋白质溶液0.5%～2%起始浓度较合适,对于粘多糖以1%～2%为起始浓度为宜 C、T:当乙醇与水混合时,会放出大量的稀释热,使溶液T显著升高,对不耐热的pro影响较大。解决办法:搅拌、少量多次加入,以避免温度骤然升高损失pro活力。另一方面温度还会影响有机溶剂对pro的沉淀能力,一般温度越低,沉淀越完全。但太低温度杂蛋白可能过多。 D、pH值:在确定了[乙醇]以后,pro最低溶解度出现在蛋白的pI处,因此可以通过调节pH值来选择性分离蛋白质。 E、加入金属离子（相当于结合了金属离子沉淀,不过介电系数降低有利于金属离子结合到蛋白成盐而沉淀） 有机溶剂沉淀法操作注意事项 2021/2/6 * 机理:聚乙二醇PEG 分子利用其庞大的体积和分支,从溶剂排斥蛋白质,导致蛋白结合;剥离蛋白水合膜;聚合物与被分离物质共沉;被分离物质在水相和聚合物间分配;被分离物与聚合物形成复合物。 优点:1. 室温 2. 颗粒大,易于收集 3. 提高蛋白质的稳定性 4.生物相容性好 缺点:PEG 溶液相难和蛋白样品分离（DEAE-纤维素吸附蛋白,而PEG不吸附）;且粘度高;价格贵。 1.3.4 非离子型聚合物沉淀 2021/2/6 * 机理:架桥;剥离蛋白表面水膜;电中和效应 常用材料: 聚丙烯酸（pH 2.8 90%蛋白沉淀） 聚甲基丙烯酸 聚乙烯亚胺 聚苯乙烯季胺盐（pH 10.4, 95% 蛋白沉淀） 1.3.5 聚电解质沉淀 2021/2/6 * 原理: 金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。例如锌易与組胺酸残基中咪唑基结合,使蛋白质的等电点转移,从而降低蛋白质的溶解度。 也有金属离子能氧化巯基,形成蛋白分子通过巯基聚集而形成沉淀。 有些过渡态金属由于可接受成对电子,有多个配位部位可起到蛋白分子间（特别是变性分子间）搭桥,形成网络状盐结构,而聚集蛋白形成沉淀。 特点:有时候产生变性（在沉淀过程中） 需要分离去金属离子,特别是重金属 1.3.6 金属离子沉淀 2021/2/6 * 一般可分三类: ①能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子,如:Mn2+、 Fe2+ 、 Ｃo2+、 Ni2+ 、 Ｃu2+、 Zn2+ 、 Cd2+ ; ②能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子,如:Ca2+ 、 Ba2+、 Mg2+ 、 Pb2+ ; ③能巯基化合物强烈结合的一些金属离子,如:Ｈg2+ 、 Ag2+ 、 Pb2+ 。 实际应用时,金属离子的浓度常为0.02mol/L。复合物中金