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酚氯仿法提取 DNA 主要步骤和原理 酚氯仿法提取 DNA 主要步骤： 1.将动物组织放在 1.5ml 的离心管中，分别用 75%、50%酒精和纯水梯度脱酒精。每个梯 度脱水时间为 5-10min 2.将组织放入研钵中，加入适量 DNA 裂解液（ 300 μl），研磨后再加入 300 μlDNA裂解液 冲洗研磨棒。 3.将研磨好的组织液用移液枪加到 1.5ml 离心管，在管中加 10 μl蛋白酶 K ，用封口带将离 心管封口，放入摇床（ 56℃,5h）。 4.加入等体积的 Tris 饱和酚（ 500 μl），摇匀（ 10min）。 5.离心： 12000R，7min，4℃。离心后分成上中下三层，上层为 DNA ，中层为蛋白质，下 层为有机质。 6.吸取上层液体加入新的离心管。 7.配制 Tris 饱和酚：氯仿：异戊醇 =25:24:1。 8.在含有上清液的离心管中加入 Tris 饱和酚、氯仿和异戊醇混合液 450 μl，摇匀 10min。 9.离心： 12000R，7min，4℃。 10.吸取上清液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液 400 μl（氯仿：异戊醇 =24:1）。 11.离心： 12000R，7min ，4 ℃。 12.吸取上清液加入新的离心管，加入 2.5 倍经过 -20℃冷冻的 100%的酒精。 -20℃过夜。 13.将样品取出， 12000R，7min ，4 ℃离心。 14.弃上清，留白色沉淀（ DNA ），加 400 μl的 75%的经过 -20℃冷冻的酒精，反复吹打溶 解。 15.重复第 14 步骤 2 次（用 75%酒精洗三次）。 16.提取 DNA 完成。 溴氯仿法提取 DNA 的原理： 用酚抽提细胞 DNA 时，有什么作用？ 使蛋白质变性，同时抑制了 DNase 的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与 DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。 使用酚的优点： 1. 有效变性蛋白质； 2. 抑制了 DNase 的降解作用。 缺点： 1. 能溶解 10-15%的水，从而溶解一部分 poly （A ）RNA 。2. 不能完全抑制 RNase 的活性。 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚－氯仿抽提细胞基因组 DNA 时，通常要在酚 -氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气 泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相 及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀 DNA 时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀 DNA 时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如 NaCl 或 NaAc ，Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。 原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（ DNP ）可溶于水或浓盐溶液（如 1mol/L 氯化 钠），但在 0.14mol/L 氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（ RNP）则在 0.14mol/L 氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。 将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（ SDS）溶液，使 DNA 与蛋白质 分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到 1mol/L ，使 DNA 溶解。加氯仿 -异戊醇去除蛋白 质，也可重复该步操作得较纯 DNA