血清白蛋白的分离纯化与鉴定.docxVIP

PAGE3 / NUMPAGES3 画面 出镜/不出镜 声音 画面效果 片头 血清白蛋白的分离纯化与鉴定 10秒左右课题片头 1 出镜 血清白蛋白是一种水溶性很强的蛋白质，其结构稳定，能结合多种小分子，在医学临床及生物领域有着广泛的应用。与γ球蛋白相比，白蛋白在血清中的含量更多，约占总量的60%，其分离纯化方法与γ球蛋白相类似，采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过滤层析、离子交换层析相结合的方法分离纯化出血清白蛋白。但由于白蛋白与γ球蛋白的溶解度、等电点、分子量等都不同，因此，白蛋白与γ球蛋白的分离纯化又在操作方法上有所不同，下面我们以γ球蛋白的分离纯化为对照，介绍一下白蛋白分离纯化的方法。 2 不出镜 首先用硫酸铵盐析法做初步分离，在半饱和的硫酸铵溶液中，球蛋白沉淀析出，而白蛋白仍溶解在溶液中，离心后白蛋白主要在上清液中；之后用葡聚糖凝胶层析法除去白蛋白中含有的硫酸铵，操作方法与γ球蛋白相同；最后，通过DEAE纤维素阴离子交换层析法进一步分离纯化出白蛋白。将白蛋白溶解在0.02mol/L pH6.5的醋酸铵缓冲液中，加到DEAE纤维素层析柱上，在此pH下，DEAE纤维素带正电荷，能吸附带负电荷的白蛋白、α球蛋白和β球蛋白，用0.06mol/L的醋酸铵缓冲液进行洗脱，提高盐浓度，使离子交换柱上的β球蛋白及部分α球蛋白被洗脱下来，继而将盐浓度提高至0.3mol/L，则白蛋白可被洗脱下来。此时，收集到的即为纯化的白蛋白，可用于后续的定性定量分析。 PPT2 3 不出镜 目前，蛋白质的定量方法有很多，包括凯氏定氮法、Folin-酚试剂法、紫外吸收法、考马斯亮蓝法等。其中，紫外吸收法操作简单、灵敏、迅速，而且不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定，因此，我们本次实验采用紫外吸收法定量检测白蛋白的浓度。 PPT3 4 不出镜 由于蛋白质中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的吸光度值（A280）与其浓度成正比关系，可用作定量测定。下面我们介绍一下紫外吸收法的具体操作方法。 PPT4 5 不出镜 1.制作标准曲线：按表1分别向每支试管内加入不同体积的标准蛋白和蒸馏水，混匀后，在280nm波长处以1号管调零，测定各管吸光度值。以蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘出标准曲线。2.样品测定：取纯化后的白蛋白溶液，测定其在280nm波长处的吸光度值，并从标准曲线上查出白蛋白的浓度。若测得的白蛋白浓度过高，可按适当的比例稀释之后重新进行测定。测完之后的样品回收到原试管中保存。 PPT5 6 出镜 我们利用紫外吸收法测定了纯化后白蛋白溶液的浓度，对其进行了定量分析。但对于纯化后白蛋白溶液的纯度以及蛋白质的分子量等并不清楚，因此，还需要对白蛋白溶液进行定性分析。我们常用的实验方法是SDS，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 7 不出镜 SDS是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，通常用于提纯过程中蛋白质纯度的检测以及蛋白质分子量的测定。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是单体丙烯酰胺和交联剂亚甲基双丙烯酰胺在加速剂和催化剂的作用下，聚合交联成三维网状的凝胶，并以此凝胶为支持物的电泳方法。在电泳时，蛋白质的迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷数、分子量大小及其形态，如果在PAGE系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠SDS，则SDS会将蛋白质的二硫键、氢键及疏水键打开，使蛋白质变性，带有大量负电荷的SDS包裹在变性蛋白质表面，使蛋白质本身带有的电荷被忽略，从而使不同蛋白质分子的迁移率主要取决于蛋白质分子量的大小。因此，利用SDS可测定蛋白质的分子量。下面我们介绍一下SDS的具体操作方法。 PPT6 8 不出镜 1.制板：将长短不等的两块玻璃板洗净晾干后安装好。 PPT7 9 不出镜 2.制备分离胶：根据所测蛋白质分子量的范围，选择适当的分离胶浓度，配制分离胶，本实验选用12%的分离胶，按照表2中各试剂的用量和顺序配制分离胶。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内，留出梳齿的齿高加1cm的空间停止灌胶，并小心覆盖一层蒸馏水或正丁醇，约30min聚合完成。待分离胶聚合完全后，除去覆盖的蒸馏水或正丁醇，并用吸水纸尽可能的吸干残液。 PPT8 10 不出镜 3.制备浓缩胶：按照表3中各试剂的用量和顺序配制5%的浓缩胶。配完后立即用移液枪将浓缩胶加在分离胶上，灌满后小心地插入合适的电泳梳，避免出现气泡，聚合约30 min。 PPT9 11 不出镜 4.电泳槽安装：安装时注意电极方向，短玻璃板位于阴极一侧，长玻璃板位于阳极一侧。5.加样：室温下聚合30min，小心拔出电泳梳，用双蒸水涮洗样品孔，去除未聚合的丙烯酰胺