血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定.pptVIP

生物化学综合实验 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 实验原理 分离方法 沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法 层析法 电学法 电泳法 等电聚焦 超速离心法 离子交换层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析 实验流程 硫酸铵盐析法粗分γ-球蛋白 葡聚糖凝胶过滤层析脱盐 γ-球蛋白纯化液的浓缩 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定 离子交换层析纯化γ-球蛋白 盐析法粗分离血清γ-球蛋白 盐析法是根据不同蛋白质在不同浓度的中性盐溶液中溶解度不同，从而分别析出，达到彼此分离的方法。 常用的中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 盐析法粗分离血清γ-球蛋白 盐析步骤 取离心管一支加入血清 2ml 加入2ml 0.9% NaCl摇匀 边搅拌混匀边缓慢滴加饱和(NH4)2SO4 4ml 倾弃 上清液（主要含清蛋白） 沉淀用1ml 0.9% NaCl搅拌溶解 逐滴加饱和(NH4)2SO4 2ml,摇匀 倾弃上清液（主要含α、β球蛋白） 沉淀即为初步纯化的γ－球蛋白 加入0.0175mol/L磷酸缓冲液（pH=6.3)1ml溶解 γ－球蛋白 粗提液 静置10min，5000rpm/min离心10min 静置10min，5000rpm/min离心10min 葡聚糖凝胶层析脱盐 欲去除盐析法分离得到的球蛋白粗提液中的大量盐，通常有两种方法： 凝胶层析法、透析法 本试验采用葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方法除去γ球蛋白粗提液中的硫酸铵，以便下一步用离子交换层析方法进一步提纯γ球蛋白。 凝胶层析原理 凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小不同随流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。 ④凝胶的再生：不断加入洗脱液，使NH4+全部流出 ②上样 γ－球蛋白粗提液 ①装柱 保持层析柱垂直；葡聚糖凝胶G-25，柱高18-20cm；凝胶上方留1-2mm的水 流速：每分钟10滴左右 PBS缓冲液，收集1ml/试管 ③洗脱 黄色（NH4+） 白色沉淀（蛋白质） 白色比色板（奈氏试剂） 黑色比色板（10%三氯醋酸） DEAE－纤维素离子交换层析 离子交换层析是一种常用的、通过使用各种类型的离子交换剂达到分离纯化目的的层析方法。离子交换剂是通过化学反应将带电基团引入到惰性支持物上形成的固体物质，在实验中作为固定相。如果其带负电，则能结合阳离子，称为阳离子交换剂；如果其带正电，则能结合阴离子，称为阴离子交换剂。可根据实验需要，选择不同的离子交换剂进行离子交换层析。 DEAE（二乙基氨基乙基）－纤维素含有可离子化的碱基，可与氢离子结合，成为带正电荷的阴离子交换剂。 本实验采用0.0175mol/L pH6.3 NH4Ac缓冲液进行洗脱。 DEAE－纤维素离子交换层析纯化γ－球蛋白 纯化步骤 将脱盐后的球蛋白加于DEAE柱上（方法同凝胶过滤），用0.0175mol/L pH6.3 NH4Ac缓冲液洗脱，流速10—15滴/min，用小试管连续收集流出液（约1.0ml/管）；用10%三氯醋酸检测蛋白质的分布情况，收集含量最高的部分，浓缩做纯度鉴定。用该缓冲液洗脱下来的即是γ－球蛋白。 γ－球蛋白纯化液的浓缩 每毫升纯化γ－球蛋白溶液加Sephadex G-25 0.25g，摇动2～3min，3000r/min离心5分钟，上清即为浓缩γ-球蛋白（或用冷冻干燥仪使其浓缩）。 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定 COO- COO- COOH ╱ + H+ ╱ + H+ ╱ Pr Pr Pr ╲ + OH- ╲ + OH- ╲ NH2 NH3+ NH3+ pHpI pH=pI pHpI 蛋白质电泳的原理： 阳离子 兼性离子 阴离子 1. 以醋酸纤维薄膜作为支持体的一种电泳方法。 2. 在pH8.6巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电场中均带负电荷，向正极移动。 3. 带电荷多、分子量相对小的泳动速度快；带电荷少、分子量相对大的泳动速度慢。 醋酸纤维素薄膜电泳原理 电泳步骤 1.点样：取经巴比妥缓冲液浸透的薄膜，滤纸吸去表面多余 水分，在无光泽面距一端2cm处用铅笔划一加样线。点样 器蘸取血清/样品，垂直压在加样线上，待样品渗入薄膜， 无光泽面向下平贴在电泳槽支架