蛋白质的分离纯化.pptVIP

三、根据电离性质不同的分离纯化方法 　　　在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳—带电粒子在电场中移动的现象。 １、电泳 几种常用的电泳 纸电泳 醋酸纤维薄膜电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) (可分为圆盘电泳和垂直平板电泳） 琼脂糖凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦(IEF) 双向电泳 蛋白质的纯化方法 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。 离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素,如羧甲基纤维素(CM纤维素）等，阴离子交换纤维素,如二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤维素）等。 带正电荷多的蛋白质与纤维素结合较强，而带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。 2.离子交换层析法 离子交换层析的固相是离子交换体，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。 阳离子交换基； 阴离子交换基。 阳离子交换层析过程 离子交换树脂 蛋白质 高离子强度洗脱液洗 高离子强度洗脱液洗 加样 平衡液洗 收集 依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。 当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。 亲和层析法 常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖凝胶等。 含配体溶液 收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白 混合蛋白样品 平衡液 带有配体的树脂珠（或胶粒） 亲和层析过程 * * * 蛋白质的分离纯化 一.?分离纯化蛋白质的意义 1.研究蛋白质的结构与功能： 要求纯度高，不变性； 2.提取活性的酶或蛋白质： 必须保持天然活性状态； 3.作为药物或食品添加剂： 纯度要求一般。 二、蛋白质提纯的总目标： 增加制品纯度或比活力，设法除去变性的蛋白质和其他杂蛋白，且希望所得的蛋白质的产量达到最高值。 一.蛋白质分离纯化的一般程序 1.前处理 生物组织 破碎、溶解、离心分离 蛋白质提取液 2.粗分级 盐析、等电点沉淀、超滤、有机溶剂分级分离 3.细分级 层析、电泳 精制品 4.形成产品 结晶或干燥 适宜介质 1、根据溶解度分 等电点沉淀 盐析（常用硫酸铵） 有机溶剂沉淀 3、根据电离性质分 电泳 离子交换层析 2、根据分子大小分 透析或超滤 密度梯度离心 凝胶过滤层析 二、分离纯化的方法 4、利用配体特异亲和力： 亲和层析 三、根据分子量大小不同的分离纯化方法 １、 2、密度梯度离心 层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。 层析因固相介质不同又分为凝胶层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等各种层析。 3 层析 将作为固相成分的不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。 然后加样品，再用适当的溶剂洗脱。 样品中各种成分通过柱子取决于与固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脱出来，达到将各个成分分离的目的。 （1）凝胶层析（gel chromatography）常出现多种名称 ： 如凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析等。 凝胶层析的定义： 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 。单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛