蛋白质的分析鉴定(做完 未输出).pptVIP

4.福林试剂反应 酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应） 福林试剂：磷钼酸-磷钨酸 福林试剂是多种化合物配制成的混合物。蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比， 可用比色法测定。 与双缩脲法结合Lowry法 在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应 蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物 灵敏度提高100倍 　 5.考马斯亮蓝G-250 本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色 与蛋白的亲和力强，灵敏度高 11000微克/毫升 * Lowry 法指的是在双缩脲法的基础上通过添加福林一酚试剂来增加蛋白质的分析灵敏度，可以适用于双缩脲法无法测定的低蛋白含量样品。 其原理是蛋白质与碱性铜溶液中的铜离子络合，使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。 Lowry 法中蛋白质与铜离子作用生成的亚铜离子作为催化剂，催化福林-酚试剂还原。它的缺点是分析时使用的试剂多、反应慢、干扰物质较多、需要对PH 进行控制以避免试剂分解(用pH= 10~10.5 的缓冲溶液)，在进行准确分析时需要进行时间控制。 * 蛋白质的鉴定与分析 一. 纯度鉴定 （1）电泳法 （2）化学法 （3）仪器法 二. 分子量测定 (1) (2)利用凝胶过滤法测定分子量 公式：Ve－Vo = a－b logM logM = K1－K2Ve (3)利用SDS—PAGE法测定分子量 公式： logM = K1－K2μR (4)质谱法 (5)通过渗透压测定蛋白质分子量 三.蛋白质含量测定 （1）凯氏定氮法 （2）紫外吸收法 （3）双缩脲法 （4）福林试剂反应 （5）考马斯亮蓝G-250法 2、紫外吸收法 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。 蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物。 红紫色络合物 (碱性溶液) Cu2+ 3、双缩脲法：两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色复合物。肽键越多颜色越深；受蛋白质特异性影响小。 蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度 * Lowry 法指的是在双缩脲法的基础上通过添加福林一酚试剂来增加蛋白质的分析灵敏度，可以适用于双缩脲法无法测定的低蛋白含量样品。 其原理是蛋白质与碱性铜溶液中的铜离子络合，使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。 Lowry 法中蛋白质与铜离子作用生成的亚铜离子作为催化剂，催化福林-酚试剂还原。它的缺点是分析时使用的试剂多、反应慢、干扰物质较多、需要对PH 进行控制以避免试剂分解(用pH= 10~10.5 的缓冲溶液)，在进行准确分析时需要进行时间控制。 *