构建表达载体的实验流程及其必知事项.pptVIP

构建表达载体的 实验流程及其注意事项 ;把目的基因置于以适当的载体，转化细菌后，筛选所需的细菌克隆。摇菌后可得到大量含目的基因的表达载体 ;分子克隆实验若纸上谈兵，似乎轻而易举；但要付诸实践，却又举步维艰，谈何容易。大多数实验都是步骤繁多，若一着不慎，即会陷入困境。 验证每步产物，设置对照以检查每一反应的效率，都是可取的良策。而要对上述问题应对自如，又必须透彻理解每一步实验流程所涉及的实验原理。 ——第一版前言（p11） 《分子克隆实验指南》 第二版 ，1996，科学出版社;汇报内容;如何阅读质粒图谱;1、杀菌机理： 四环素（tet): 四环素与核糖体30S亚基结合，抑制核糖体的转位。 Tet 抗性基因编码一个399的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 氨苄青霉素（amp)：氨苄青霉素可与细菌膜上一些与细胞壁合成有关的酶结合 并抑制其活性。Amp基因可降解氨苄青霉素。 氯霉素（Cm或cat)：氯霉素与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质的合成。 Cat 基因编码一个四聚体细胞蛋白，催化氯霉素羟乙酰氧衍生物的形成。 卡那霉素（kan)：可与核糖体结合，抑制蛋白的合成。 卡那霉素可被氨基糖苷磷酸转移酶(APH-II)灭活。 2、溶液配制： 一般配成50或100mg/mL，抽滤，-20℃保存备用。;遗传转化所用载体（1）;候选基因功能分析;汇报内容;一、克隆位点的选择 1、首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。 2、然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。 二、保护碱基数（直接酶切PCR产物） 1、在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基。 2、 一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行； 有些则加3个以上，NdeI就属这类，需加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。 ;目的基因获得;汇报内容;基因工程所用的酶;酶的质量标准 酶活单位：酶量，时间 酶的浓度：10 units/uL; 20 uints/uL等 保存条件: -20～-30 ℃ 切割位点：有无其他活性 酶切体系: buffer及与其它酶双切的buffer等 所用底物： DNA量，切后再连接的程度 反应温度：一般为37℃,但许多酶对温度有特殊要求 甲 基 化： 星 活 性: 所加酶量过多 保护碱基:;核酸酶操作注意事项;内切酶buffer;一）酶切不开或酶切不完全 ？？;二）酶切后电泳时出现smear？？;汇报内容;过柱法回收;汇报内容;连接反应;注意： 1、 一定要检测回收效果，带亮（浓度高）方可用于下一步连接。 通常，重组分子只有几十万分之一。 回收片段中无酒精等影响连接的残留。 2、将目标片段、载体片段的泳道相邻，根据亮度估测其浓度。 连接时，目的：载体=3：1（分子个数） 别忘记长片段插入的EB多。分子个数一样多时，长片段更亮。 3、 如果是单酶切，为了防止载体自身环化，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理，去掉酶切后5‘端的磷酸。 酶切结束，向酶切体系中加入1.0μL CIP，37 ℃ 0.5-1hr即可。 4、 对照质粒生长，而连接产物转化不成功，这说明你的连接是不成功。 5、连接液不能反复多次冻溶，因为里面含有ATP。建议不要使用生产日期不明的连接酶和连接液（看似很会过日子，实际是个败家子）。;汇报内容;热激转化;重组质粒筛选;质粒提取：碱裂解法;质粒纯化：;质粒验证