脂肪干细胞分离培养相关资料和仪器.docVIP

背景知识 临床上因先天性I畸形、外伤及肿瘤切除术等各种原因所造成的软组织缺损的 修复是整形修复外科面临的重大难题之一。脂肪组织瓣、胶原注射剂、真皮移植、 人工合成材料以及游离脂肪组织移植虽已被广泛应用于临床工作屮，但人工合成 材料易产生界物排斥反应，而口体纽织移植乂带来供区的继发畸形，临床最常采 用的游离脂肪组织移植也而临着移植物再吸收，纤维组织替代和油脂囊肿形成等 问题。通常移植物体积减少40 — 60%的现象，究其原因，游离移植后数以万计 或十万计脂肪细胞团块无法从受区获得足够的营养供应，导致移植后的脂肪细胞 大量坏死。即使幸运得以存活的脂肪细胞也丧失继续增殖的能力，极易褪化，移 植后数刀逐渐丧失脂肪细胞特性，逐渐被成纤维细胞所替代。因此，如何有效保 证游离移植物的血液供应，以保持其旺盛增殖状态，维持其脂肪细胞特性，是脂 肪组织移植成功的关键。组织工程技术的出现为临床上彻底解决组织缺损等难题 提供了一条革命性的途径。它能以少量种子细胞经体外扩增后与生物材料结合, 修复较大的组织或器官缺损，重建缺损部位的生理功能。为最终实现无损伤修复 组织缺损和真正意义上的形态、结构与功能重建开辟了新途径。 继骨髓基质细胞Z后，抽脂来源的人脂肪组织干细胞成为半今干细胞研究领 域的又一热点。脂肪组织作为干细胞來源的原因之一是由于从脂肪组织提取干细 胞取材容易、量大、可反复取材、损伤较小、细胞增殖快速、能反复分裂而不衰 老等优点，且可以把抽脂术屮过去弃之的脂肪组织悬液变为人干细胞库的重要来 源，可作为多种纽织工程的种子细胞，具有非常重要的科学研究和应用价值。 据报道全球每年约完成一百万个吸脂手术，吸脂术能产生大量的脂肪抽吸 物，脂肪组织抽取后残留于供区的脂肪组织仍可扩増，对供区的损伤也小，可以 反复进行。抽吸物屮包含脂质和液体两部分，脂质的部分包括抽吸的脂肪组织碎 片，这些碎片是由于吸脂管的相互运动和真空压力作用使脂肪组织变成了碎片。 液体部分其基本组成包括：⑴麻醉纱肿胀液屮的生理盐水；（2）外周血液；（3）来 源于脂肪组织的细胞和组织碎片。H前有关脂肪抽吸物的脂质部分已经被证实可 以分离出具有向骨、软骨、脂肪、肌肉等多向分化能力的干细胞，而液态部分屮 有报道也包含类似的干细胞。我们可以同吋富集脂质部分和液体部分来源的干细 胞，以增加干细胞的数量，从而提高移植脂肪组织的成活率。 二、 脂肪干细胞分离培养 2.1接收脂肪组织，用75%的酒精擦拭装脂肪组织的容器外壁； 2.2分装脂肪组织，将脂肪组织分装到T175培养瓶屮：移液管，去吸头，于脂 肪采集瓶先吸取下层红色液体弃掉，剩余上层脂肪混匀后进行分装。 2.3洗涤脂肪组织：向T175培养瓶屮加入适量氯化钠注射液，充分洗涤脂肪组 织； 2.4胶原酶I消化：加入胶原酶I溶液，封口膜封口，37°C消化，直到看起來较 为平滑。 2.5分离基质血管组分(SVF)：将消化后的组织分装到50ml的离心管屮，室温 离心,得到的沉淀即为SVF。 2.6净化沉淀：离心后，SVF沉积于离心管底部，除去上层油脂和下层的胶原酶 溶液。适量生理盐水重悬细胞，吹散，室温离心。 2.7红细胞裂解：加入适量红细胞裂解液，裂解沉淀屮的红细胞。再次离心。 2.8细胞种瓶进行后续培养或者直接输注给病人应用于临床。 每ml抽脂得到的脂肪组织可以分离得到3X105个脂肪干细胞。 培养屮细胞 成脂诱导分化 成脂诱导分化 所需仪器如下: 设备名称 型号 备注 超净工作台 苏净安泰，SW-CJ-2F 1台 电动移液器 Labnet 2把 电子天平 赛多利斯，ATL-224-I 1台 1X71倒置式研究型显微镜 奥林巴斯，1X71 一台，可以暂吋用普通显 微镜替代 架盘药物天平 马头牌，JYT-20A ?个 台式离心机 久保田,8420 __?台 西门子冰箱 BCD-198 1台 二氧化碳培养箱 三洋,MCO-20AIC 一个（可暂吋不用配制） 台式恒温振荡器 上海粕宏，THZ-312型 真空泵 细胞培养房吸废液用