生物制药工艺技术_将目的基因导入受体细胞_将目的基因导入受体细胞.ppt

学习情境4微生物工程菌发酵制药技术 将目的基因导入受体细胞 * * 将目的基因导入受体细胞 原核细胞、真菌、动物细胞、植物细胞都可以作为受体细胞，当然，并不是所有的细胞都能做受体细胞。 受体细胞(receptor cell) 又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。 1.受体细胞 对于宿主细胞其应该： 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 发热量低，需氧低， 适当的发酵温度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 产物的产量、产率高，产物容易提取纯化。 原核生物细胞受体 容易摄取外界的DNA，增值快，基因组简单，便于培养和基因操作。 如，广泛应用的大肠杆菌、苦草杆菌、蓝藻和农杆菌等 酵母 某些性状因类似原核细胞，也被用作基因克隆载体。 动物细胞 因体细胞不易分化，所以采用生殖细胞、受精卵细胞和胚胎细胞作为基因转移的受体细胞。 植物细胞 除了真核生物细胞共有的特性外，最突出的优点就是体细胞的全能性。不足之处就是有坚硬的细胞壁。 目的基因 导入受体细胞有转化、转导、杂交、细胞融合、脂质体介导转移、显微注射技术、电激转化等。 2.重组DNA 分子送入受体细胞的方法 （1）转化：是指感受态细胞直接吸收外源性DNA，导致受体细胞某些遗传特性发生改变。 优点：操作方便，方法简单，不需要特定的设施，转化率较高等。 大多数细胞在正常状态下并不能发生转化。 感受态细胞：能从周围吸收DNA的细胞称为感受态细胞。 如何获得更多的感受态细胞呢？ 电击法 CaCl2等化学试剂法： 将对数期的宿主细胞在低温低渗CaCl2（ MgCl2、CsCl、liCl）溶液中处理，改变细胞壁及细胞膜的通透性，形成易于吸收重组DNA分子的原生质球，即感受态细胞。 如，用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 2.目的基因导入受体细胞的方法途径 a. 热激法转化感受态细胞 　　　b. PEG介导的原生质体转化 　　　c. 高压电穿孔法转化 　　　d. 显微注射法转化 　　　e. 接合转化　　　f. 噬菌体转染 大肠杆菌常用转化方法的比较 104-5 接 合 转 化 106-9（100Kb） 电 穿 孔 法 107-8 噬菌体转化 105-6 原生质体转化 107-8 Ca 诱 导 转 化 效 率 转 化 方 法 ①热激法转化感受态细胞 在某些情况下，CaCl2只影响DNA的结合，并不影响细胞的吸收，当DNA分子加到处理的细胞内，仍然吸附在细胞的外部，并没有转化到细胞质中，将DNA带入感受态细胞的条件可提高温度到42℃。 ②高压电穿孔法 基本原理　　在高压电场的作用下，细胞膜发生临时性破裂形成微孔，细胞外环境中的核酸分子便会穿孔而入，并最终进到细胞核内部。 影响因素　　脉冲的最大电压 脉冲持续的时间 与DNA浓度则无多大关系 电穿孔转染效率主要取决于所用的细胞类型。 对于不适合用传统方法转染的细胞，用电穿孔法得到的永久转化的频率约为10-4～10-5之间。 ③显微注射法转化 在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖手术、人工受精、细胞核移植、基因注入、细胞内微量注射、胚胎切割等的技术。