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? 分析讨论 ? 由实验结果可以看出产酸量是随着时间 增加而增加的，柠檬酸不断地积累；但 是由于测量过程中存在误差，故还原糖 含量并不是一直递减， PH 不停降低最后 稳定在 1.5 ? 思考题 ? 1. 记录实验数据并绘制柠檬酸的发酵曲线 图 ? 答：见实验结果 ? 2. 实验室如何完成发酵罐的接种操作？ ? 答：先灭菌，然后检查发酵罐的各项指 数，移开接种附近的胶管，铁挡板围住接 种口后用酒精喷壶朝接种口处喷酒精点着， 将接种圈沾酒精点着后套住接种口处，将 扳手或钳子上的火焰后迅速放入装 95 ％乙 醇的搪瓷缸容器里；将接种瓶在火焰处拨 开后迅速倒入发酵罐内，完毕后用钳子夹 出螺帽拧上，整个过程确保无菌操作。 生物技术专业系统实验 ? 发酵工程实验 石秋晓 （ 50 % ） 田 爽 （ 50 % ） 星期一 上 午 第 三 组 实验一 发酵工程实验总体介绍和 安全知识 思考题 1. 请设计从土壤中筛选谷氨酸产生菌的实验方案。 要求： 从培养基配方设计说明，初筛、复筛 等操作步骤，产物检测确认方法，用到的实验器 材等几方面设计实验。 答：在已报到的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外，它们都有一些共同特点。革兰氏阳性，菌 体为球形，短杆至棒状，不形成芽孢。没有鞭毛，不能运动。需要生物素作为生长因子， 在通气条件下才能产生谷氨酸。 实验器材： 铁铲，三角瓶，试管，吸管，培养皿，摇床，发酵罐，高压灭菌锅，牛皮纸袋， 量筒，酒精灯，涂布器，接种针。 选择培养基： 琥珀酸钠 2g ，磷酸氢二钠 1.6g ， 7 水硫酸镁 0.6g ，脲 5g ，生物素 30 微克，硫酸铁 和硫酸锰各 2mg ，水 1.0L ， pH7.0~7.2 初筛培养基：葡萄糖 12% ，玉米浆 0.8% ，磷酸二氢钾 0.2% ，硫酸镁 0.04% 。 pH7.0 复筛培养基： 葡萄糖 18% ，玉米浆 0.5% ，甘蔗糖蜜 0.15% ，磷酸二氢钾 0.2% ，硫酸镁 0.04% ， pH7.0 实验步骤： a. 产谷氨酸菌为细菌，则采集田园土为好，做土壤浸出液，有限稀释并牛肉膏蛋 白胨培养基平板涂布培养，依据菌落特征挑出产谷氨酸菌，斜面纯化培养（也可直接用选 择培养基选择出产谷氨酸菌） b. 初筛 : 上面纯化的菌株有多种，每株两瓶分三批进行初筛。 放瓶后，测定谷氨酸含量。从中选出产量较高的 6 株左右，摇瓶培养。 c. 复筛：经初筛选 出的 6 株，继续进行摇瓶复筛实验，发酵周期 46h ，以生产菌作为对照，共进行了 3 次对比 试验，选出产谷氨酸最高的两株。 d. 发酵罐发酵，并检测产物。方法有：从发酵液中提取 谷氨酸一般用等电点法，离子交换法，金属盐沉淀，盐酸盐法和电渗析法。菌体鉴别用革 兰氏染色法（培养基同复筛） 实验二 柠檬酸产生菌的分离及筛选 1. 察氏 - 加酸培养基上菌落生长情况 ? 实验结果 2. 察氏 - 多民培养基上菌落生长情况（产酸情况） 1. 由实验结果 1 可知，黑曲霉在察氏 - 加酸培养基上生长快，且生长状况 比青霉菌好太多，这两种菌均耐酸，但青霉菌耐酸能力明显比黑曲霉 弱的多。 2. 由实验结果 2 可知： a. 编号 4 是无污染中比值最大的，而所有培养基中比值最大的为编号 1 。 但其未接种时培养基已被产酸菌污染，污染菌和接种菌来源不同，很 可能不是同一菌种，因此应用编号 4 作为摇瓶初筛用菌株。其固体培 养时产酸能力较强。 b. 青霉菌不产酸，但可以在察氏 - 多民培养基上缓慢生长，可能是对碳 源的利用不好，或之前在很低 PH 下菌种受损。 c. 编号 1 的污染是倒培养基时，被空气中杂菌污染；编号 5 的污染可能 是接种针较长，接种时弹落孢子。从而出现多个菌斑。 d. 在固体培养基中产酸能力与液态培养基中存在差异，在固体培养基 上产酸能力强，在液体培养基中不一定强。 ? 分析讨论 1 . 黑曲霉柠檬酸产生菌菌株富集应考虑利用哪些特征来进行富集？ 答： a. 温度，培养温度应适宜其生长 b. 培养条件适宜， C 源的利用，对其他菌有筛选效果 c.pH ，因黑曲霉耐酸性很高，因此可以利用低 pH 的培养基，来排除杂菌 污染，并纯化富集。 d. 利用固体点植在察氏 - 多民培养基上纯种筛选富集。 2. 观察记录在察氏 - 加酸培养基上菌落生长情况。 答：见实验结果 1 3. 观察记录所挑选察氏 - 多民培养基平板上变色圈和菌落直径比值 答：见实验结果 2