dna抽提原理解析.docxVIP

分子生物学实验用到的DNA主要是质粒DNA和基因组DNA其提取的主要原理有: 1，碱裂解法制备质粒 DNA 质粒是细胞内的一种环状的小分子 DNA是进行DNA重组的常用载体。作为一个 具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外， 质粒DNA上携带了部 分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在 DNA重组中， 质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。 从宿主细胞中提取质粒DNA是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA 有三个步骤:培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒 DNA。 碱法质粒抽提用到三种溶液: 溶液 I , 50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-CI / 10 mM EDTA ，pH 8.0 溶液 II ， 0.2 N NaOH / 1% SDS 溶液III ，3 M醋酸钾/ 2 M醋酸 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH值， 因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM 葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议， 加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的 大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。 因此，如果溶液 I 中缺了葡萄糖其实对质 粒的抽提本身而言， 几乎没有任何影响。 所以说溶液 I 中葡萄糖是可缺的。 那么 EDTA呢？大家知道EDTA是 Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生 物学试剂中的主要作用是：抑制 DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I 中加入高达10 mM的EDTA无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子 都螯合掉。如果不加EDTA其实也没什么大不了的。只要是在不太长的时间里 完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的 TE缓冲液中 有EDTA如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你， 只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌 体一定要悬浮均匀，不能有结块。 轮到溶液II 了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%勺SDS等体积混合后使用的。 要先从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的 C02而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是 SDS所以才 叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳 动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer （双层膜）结构向 micelle （微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4 N NaOH即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。 如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点 而已。很多人对NaOF的作用误以为是为了让基因组 DNA变性，以便沉淀，这是 由于没有正确理解一些书上的有关 DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问， 既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加 SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。 这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这 样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩 子一样），不然基因组 DNA也会断裂。 溶液 III 加入后就会有大量的沉淀 ，但大部分人却不明白这沉淀的本质。 最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往 1% 的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。 大量沉淀的出现， 显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的 沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然 SDS不 是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在 1%勺SDS溶液中慢慢加 入5 N的NaCI，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐 导致了 SDS的沉淀。但如果你加入的不是 NaCI而是KCI，你会发现沉淀的量要 多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（ sodium dodecyIsuIfate ）遇到钾离子后变 成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate ，PDS，而PDS是水不溶的， 因此发生了沉淀。如此看来，溶液 III 加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS 中的纳离子形成了不溶性的PDS而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS分子，钾钠离子置换所 产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了， 让人高兴的是大肠杆菌的基因 组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的 DNA自然容易