流式细胞术原理及应用 .ppt

2020/11/24 同型对照抗体：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 （Fc段相同，F（ab’）2段不同） 与染色的单克隆抗体： ①相同种属来源 ②相同免疫球蛋白及亚型 ③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度 ⑤但由未免疫动物血清纯化而来 用此消除由于抗体非特异性结合到细胞表面Fc受体而产生的背景染色 B、同型对照 Isotype Control C、阳性对照 Positive Control 设置阳性对照是为了检测荧光抗体是否有效，并不是每次分析时都必须设置： 使用新的荧光素抗体时； 使用存储时间较长的荧光素抗体时。 设置阳性对照的方法： 用肯定表达有该抗原的细胞来检测； 已经证明有效的、偶联其他荧光素的该抗原的抗体。 什么是荧光补偿？纠正荧光素发射光谱重叠 为什么要进行补偿调节？ 520 400 500 600 700 575 665 FITC PE PC5 laser D、 单标对照 Single Staining Control 补偿调节方法： FL-1(FITC) FL-2(PE) FL-1(FITC) FL-2(PE) FL2 - %FL1 FL-1(FITC) FL-2(-) FL-1(-) FL-2(PE) FL1 - %FL2 Before Compensation After Compensation FITC 单标 PE 单标 什么样的补偿最合适？ 单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median值相等时为最合适的补偿。 Uncompensated Compensated FL1-FITC stain FL2-no stain FL1-FITC stain PE-Medianneg PE-Medianpos PE-Medianneg= PE-Medianpos PE-Medianneg PE-Medianpos FL1-FITC stain Overcompensated 准确补偿的重要性 补偿调节要合适 未补偿 正确补偿 FITC-PE补偿太大 PE-FITC补偿太大 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别染色 n色分析就要制备n 个补偿对照管 举例：双染实验 设门与数据分析 门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。 流式结果 十字门 线性门 黏附因子 表面受体 细胞因子 分泌到胞外的细胞因子 胞内抗原 核酸含量 核内抗原 细胞功能 细胞表面、胞浆、核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 细胞受体 细胞内钙离子 流式细胞仪检测范围 HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病 医学应用 科研应用 在免疫学研究中的应用: 鉴定免疫细胞类型 抗原特异性T细胞研究 细胞因子分泌细胞研究 全血细胞研究 凋亡检测 细胞增殖检测 干细胞向免疫细胞分化的研究 转染荧光蛋白细胞系研究 稀有细胞检测 。。。 在神经生物学研究中的应用： 神经干细胞和神经祖细胞的特性研究； 不同类型的神经细胞的鉴定和功能研究； 星形胶质细胞和胶质细胞的鉴定和功能研究； 检测细胞活性，细胞凋亡和细胞周期； 神经细胞发育过程研究 干细胞向神经细胞分化研究 。。。 流式细胞术原理及应用 一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造 二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用 精品资料 你怎么称呼老师？ 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？ 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ 教师的教鞭 “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……” “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……” 一、流式细胞术基本概念 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选技术. 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等。 对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性和定量分析。 流式细胞仪构造图 流式细胞仪五大系统 流动室与液流驱动系统 激光光源及光束成形系统 光学系统 信号检测与分析系统 细胞分选系统 流动室与液流驱动系统 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 流动室，430×180um,鞘液 1.空气加压进样 2.蠕动泵精确定量进样 激光光源与光束