凝胶色谱技术.docVIP

凝胶色谱技术 凝胶色谱法 凝胶色谱技术是六十年代初发展起來的一种快速而又简单的分离分技术，山于设备简单、操作方便,不需要有机溶剂,对高分子物质有很 高的分离效果。IT前己经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用,不但应用于科学实验研究,而且 己经大规模地用于工业生产。 一、基本理论 （一） 分子筛效益 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。 大分子物质山于直径较大,不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间,所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗 粒间隙屮扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程屮，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗 粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，屮等分子的后流出，分子最小 的最后流出，这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直 径比凝胶最大孔隙直径大的,就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。宣 径比凝胶垠小孔岚径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。 因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。综上所述，在凝胶色谱屮会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很 大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开, 但每种凝胶分离范圈之外的分子,在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子,在凝胶 床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶 床内移动距离较短，分了较小的移动距离较长。于是分子较人的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分了最不同 的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量大小不 同的多种成份在通过凝胶床时，按照分（戢大小?排队，凝胶表现分（筛效应。 （二） 色谱柱的重:要参数 ⑴柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体枳。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体枳又称“床体积， 常用vt表示。 ⑵外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。 ⑶内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi 表示。不包括固体支持物的体积（Vg）。 ⑷峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液有体枳，常用Ve表示。当使用样品的体枳很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计）， 在洗脱图屮，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Vcp当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶 位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。 二、 凝胶的种类及性质 （一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex） （DScphadcx G交联葡聚糖的商品名为Scphndcx，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉们数为凝胶得水值的10倍。例如， G?25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克,同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G?IO, G-15, G-25, G-50, G?75, G-100, G-150,和G-200o因此，“G”反映,凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。 ⑵Sephadex LH-20,是-Sephadex G-25的竣丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。 （： ：）琼脂糖凝胶： 商品名很多,常见的有,Sepharose （瑞典,pharmacia ） , Bio-Gcl-A （美国Bio-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来 维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般恬况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。 琼脂糖凝胶在40°C以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。 （三） 聚丙烯酰胺凝胶： 是一种人丁合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，山甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成 各种型号的凝胶。交联剂越多,孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品