分子生物学培训总结.pptxVIP

分子生物学实验培训总结重组DNA鉴定DNA自动测序核酸分子杂交质粒抽提和酶切鉴定载体与片段连接、感受态细胞转化DNA重组目的蛋白的表达及功能的研究RNA抽提纯化和逆转录-PCR获得目的基因细胞培养及细胞转染遗传的中心法则 1958年Crick提出以DNA为中心的遗传信息的传递规律，即DNA贮存的遗传信息通过复制传给子代DNA，通过转录传给RNA，再通过翻译传给蛋白质。遗传信息传递方向的这个规律被称为～。复制复制转录翻译蛋白质DNARNA？反转录1970年Temin和Baltimore发现RNA病毒的RNA可通过反转录（逆转录）将遗传信息传给cDNA，也可通过RNA复制或RNA转录传给子代RNA，这是对中心法则的补充。1997年疯牛病和朊病毒的出现，预示蛋白质也可逆向将遗传信息向DNA传递。DNA的结构及功能DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排在内侧。两条链的碱基通过氢键连接形成碱基对，其中A与T配对，G与C配对。两个相邻脱氧核苷酸通过3’ -5’磷酸二酯键连接。起着贮存和传递遗传信息的作用。RNA的种类CategoryRNA的功能Function转运氨基酸与蛋白质结合形成核蛋白体,起装配机的作用翻译蛋白质的模板转运核糖核酸(transfer RNA, tRNA) 核蛋白体核糖核酸(ribosome RNA, rRNA)信使核糖核酸(messenger RNA, mRNA)mRNA的生物合成mRNA Biosynthesis真核生物的结构基因由内含子和外显子组成，内含子的序列较长，且不编码蛋白质。真核生物DNA在转录过程中经剪接可将内含子部分去除，获得成熟的mRNA。由于分子生物学研究的最终产物常常是蛋白质，因此我们需要获得可翻译的mRNA。mRNA易降解，不易长期保存。将mRNA逆转录成cDNA，利用cDNA来研究基因的功能。Trizol提取RNA原理Trizol法提取细胞总RNA是目前常用的提取方法。细胞内大部分的RNA与蛋白质结合在一起，以核蛋白形式存在。 Trizol内含异硫氰酸胍和苯酚等物质。异硫氢酸胍(GuSCN)是一种强的蛋白质变性剂，不仅能使细胞裂解，同时还能有效地抑制细胞内源性RNA酶的活性。通过有机溶剂的分步抽提，最终可获得纯度较高的细胞总RNA。RNA提取注意事项 Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。如皮肤接触Trizol，请立即用大量水冲洗。 RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注意随时勤换手套，样品尽可能盖严；尽量不要对着RNA样品呼气或说话。用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。 逆转录酶RNADNA逆转录(Reverse Transcription) 逆转录指遗传信息从RNA流向DNA，是RNA指导下的DNA合成过程，即以RNA为模板，四种dNTP为原料，合成与RNA互补的DNA单链，称为互补DNA ( complementary DNA, cDNA)逆转录原理cDNA合成有两个关键因素，一是病毒RNA的质量，二是逆转录酶。逆转录酶是一种多功能酶，它能在一定的条件下，以单链RNA为模板合成第一条cDNA链。通过RNaseH活性水解RNA-DNA杂合分子中的RNA链。逆转录酶(reverse transcriptase) 催化逆转录过程的酶称逆转录酶，RNA病毒中都含有此酶。 具有三种酶活性： RNA指导的DNA聚合酶 RNA水解酶活性 DNA指导的DNA聚合酶逆转录体系RNA模板—— 3’UUAGGCCUGGAUAAGCGCCUGGA 5’逆转录酶引物—— 5’ATCCGGAC Mn2+酶活性依赖金属离子dTTPdGTP底物dATPdCTP依赖RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依赖DNA的DNA聚合酶逆转录过程中cDNA的合成逆转录引物的选择(Primer)Oligo(dT)(12-18个核苷酸组成），只有mRNA被逆转录随机六聚寡核苷酸，所有RNA均被逆转录基因特异性引物，仅产生需要的DNA逆转录的生物学意义扩充了中心法则有助于对病毒致癌机制的了解与真核细胞分裂和胚胎发育有关逆转录酶是分子生物学重要工具酶聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)PCR 基因放大连琐反应以DNA为模板，利用DNA聚合酶的特性体外扩增特定的基因片断，这种方法被称为DNA聚合酶链式反应。PCR基本原理利用高温可使DNA变性和低温可使DNA复