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不同位置土壤中枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力的比较 摘要：从月季花下、草坪上及大树下采集土壤，然后 对其进行分离得到枯草芽孢杆菌。通过对枯草芽苞杆菌利用 酪蛋白培养基产蛋白酶能力的比较，发现月季花下土壤中分 离得到的枯草芽孢杆菌产蛋白酶的能力最强。 关键词：枯草芽孢杆菌；蛋白酶；纯化 中图分类号： S188 文献标识码： A 文章编号： 1007-273X （2014）03-0012-02 随着饲用酶制剂应用研究的不断深入，人们逐渐发现了 蛋白酶在动物营养上的独特作用，蛋白酶也因此受到了越来 越多的关注。根据来源的不同，蛋白酶可分为动物源性蛋白 酶、植物源性蛋白酶、微生物源性蛋白酶等 [1] 。其中微生物 蛋白酶既有通过细菌（如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌）培 养提取的，也有通过真菌（如黑曲霉、酵母）发酵提取的。 微生物蛋白酶和植物蛋白酶由于生产成本相对低廉，在多种 工业（如饲料、食品等）上得到了广泛应用。本试验通过对 不同位置的新鲜土壤进行分离，筛选出产蛋白酶活力较高的 菌株，为微生物蛋白酶的研究奠定了基础。 材料与方法 土壤 试验用 3 份新鲜土壤：采自黄淮学院某月季花下、草坪 上及大树下，距土壤表层约 10 cm。 方法 菌株分离 将土样平摊于一干净的四方纸上，从纸 的四角及中间各取适量的土样，混匀。称取 1.0 g 混匀土样 与 20 mL 肉汤培养基于锥形瓶中混合，封口。再将其放入 80 C恒温水浴锅中加热处理 10 min，然后于恒温摇床内 30 C, 150 r/min 振荡培养 24 h。 用接种环接种于营养琼脂培养基上， 30 C条件下培养 24 h[2， 3]。 革兰氏染色 将上述营养琼脂培养基上的菌落进行 涂片镜检。 在已干燥的抹片上滴加草酸铵结晶紫染色液，染色 1 min，水洗；加路戈碘液进行媒染 2 min，水洗；加95%乙醇 进行脱色30 s，水洗；加10倍稀释的石碳酸复红染液， 复染 1 min ，水洗；吸干、烘干，镜检。 生化试验 （1 ）接触酶试验。用接种环取一小环符合上述要求的 菌落涂抹于已滴有 10%过氧化氢溶液的载玻片上， 观察载玻 片上是否有大量气泡产生。 （2）V-P 试验。将符合上述要求的菌落接种于 V-P 反应 培养液中，37 C培养4 d后，取2 mL培养液和等量的 40%NaOH 溶液混合，充分振荡后观察培养液是否呈红色。 （3）水解淀粉试验。取符合上述要求的菌落接种于淀 粉培养基上，于37 C培养4 d后，在平板上滴加卢氏碘液 （需铺满菌落） ，观察平板是否呈蓝色，菌落周围有无无色 透明圈出现。 （4） 柠檬酸盐试验。将符合上述要求的菌落接种于柠 檬酸盐培养基上，37 C培养4 d,观察平板是否呈现蓝色或 桃红色。 （5） 分解酪素试验。将符合各个生化鉴定结果的菌落 接种于肉汤培养基中，置于恒温摇床机内 30 C、150 r/min 振荡富集培养24 h。然后再将其置于 80C水浴锅中加热10 min。取1 mL处理液以10倍稀释法分别稀释为 10 4、10 5、 10 6。分别取 0.1 mL 菌液涂布于酪素培养基上。倒置于恒温 培养箱中30 C培养24 h。 观察酪素平板上菌落周围是否产生透明圈，挑 H/C （透 明圈直径/菌落直径）比值大的菌种接入斜面培养基上。30 °C 培养24 h,备用。 菌种纯化 平板划线分离法在牛肉膏蛋白胨培养基 上分离纯化挑选出的菌株。 结果与分析 菌种分离 革兰氏染色阳性；镜检结果为短杆状、芽孢端生,形状 椭圆 菌种鉴定 生化试验鉴定结果见表 1。有表 1 可见，该菌对接触酶 试验、 V-P 试验、水解淀粉试验、柠檬酸盐试验均呈阳性。 由表 2 可见，月季花下分离后菌株在酵素平板上的 H/C 值最大。该菌能分解酪素，在酪素平板上菌落周围所形成的 透明圈 H/C 结果见表 2。 根据各项指标的检测结果，依照《伯杰氏细菌鉴定手 册》，可以认为筛选到的菌株为枯草芽孢杆菌 [4] ，其中月季 花下纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力最强，草坪上纯化的 枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力次之，大树下纯化的枯草芽孢杆 菌产蛋白酶能力最弱。 讨论 催化蛋白质水解的酶种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰 蛋白酶、 组织蛋白酶、 木瓜蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶等。 许多行业已开始大量利用蛋白酶，因为它既可以节省时间， 又能改善劳动卫生条件。 蛋白酶可用于蚕丝脱胶、 肉类嫩化、 酒类澄清等。 临床上可作药用， 如用胃蛋白酶治疗消化不良， 用酸性蛋白酶治疗支气管炎；加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产 品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使 用时应注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引 起皮疹、湿疹等过敏现象。 本试验通过对菌株分离、鉴定的研究，得到了产蛋白酶 的枯草芽孢杆菌，