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动物检验检疫技术 动物组织培养 动物组织培养，原来是指小块动物组织的体外培养，现在用以泛指组织、器官和细胞的体外培养。组织和器官培养，是指将组 织、整个的或部分的器官在体外培养或生长，并保持组织或器官的分化、结构和（或）功能。由于操作和应用上的限制，在病毒学 诊断中组织和器官培养应用很少，而广泛应用的是细胞培养技术。细胞培养分为单层细胞培养和悬浮细胞培养。单层细胞培养包括 静止培养和使用转瓶旋转培养，使细胞在器皿的表面生长出单层或数层细胞。单层细胞常用来分离和繁殖病毒；悬浮细胞培养，是 指细胞悬浮于营养液中繁殖的一种培养方法，它可进行连续培养，便于工业生产，常用来繁殖病毒生产疫苗。根据细胞株的不同， 细胞培养又分为原代细胞培养、继代细胞培养、二倍体细胞培养和传代细胞培养。原代细胞培养，是指直接从组织消化分散的细胞 所进行的第一代体外培养；继代细胞是指将原代细胞消化下来还能继续培养的细胞； 二倍体细胞是指染色体的数目和形态正常的继 代细胞，其中至少有 75%细胞的核型与其动物获得的正常细胞核型相同；传代细胞系是指癌变的异倍体细胞，其特点是可无限地传 代培养。 动物组织培养，主要取决于四方面因素，即培养液、血清、辅助试剂及环境。动物病毒分离主要使用细胞单层，下面介绍常用 细胞单层培养方法及与之有关的液体配制。 （一）组织培养液及组织培养相关溶液的配制 1.抗生素的配制及使用浓度 抗生素的防治对象、使用浓度见表 2-4。贮存浓度通常为使用浓度的 100-200倍。特别是在细胞正 常传代时尽量避免使用，或仅用 100IU/ml青链霉素。其他抗生素是在做病毒分离、鉴定时，怀疑污染或已出现某种污染时才参考 使用。 表2-4抗生素的配制及使用浓度参考表 抗生素名 贮存液浓度 （每毫升含量） 培养液使用浓度 （每毫升含量） 污染样品处理使用浓度 （每毫升含量） 抗菌种类 两性霉素B 250 g g 1.25 gg 2.5 g g 真菌、酵母 抗PPLO病原 50 000 g g 50 g g 100 g g 支原体、G+ 庆大霉素 50 000 g g 50 g g 100 g g G+ G-、支原体 卡那霉素 10 000 g g 50 g g 100 g g G+ G-、支原体 新霉素 10 000 g g 50 gg 100 g g G+ G- 制霉菌素 10 000IU 100IU 200IU 真菌、酵母 青霉素G 200 000IU 100-200IU 500-1 000IU G+ 硫酸链霉素 500 000 g g 100-200 g g 500-1 000 g g G+ G- 多粘菌素B 10 000IU 100IU 200IU G- 注：其中PPLC为胸膜肺炎病原体；G+和G-分指革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。 2.7.5%NaHCO3勺配制 NaHCO3 75g 双蒸水 1000 ml 将NaHCO溶解在灭菌双蒸水中。 用正压滤器除菌。 分装于50-100ml灭菌瓶中，盖紧盖子。 ⑷（5）3.0.5%酚红的配制取1-5ml接于硫乙醇酸盐（T, G） ⑷ （5） 3.0.5%酚红的配制 酚红 5g NaOH (0.1 mol/L) 150ml 双蒸水 850ml 逐滴将0 .1mol的NaOHra入酚红粉末中，研磨直至完全溶解。 ⑴ 加双蒸水至1 000ml，分装于100-500 ml瓶中。 在0.104-0.112MPa条件下高压灭菌 15min。 取1-2ml接于 ■培养基中进行无菌检验。 贮存于室温或普通冰箱，盖子要盖紧。 NaCl 8.0g KCI 0.2g CaCI2?2H2O 0.132g MgCI2?2H2O 0.1g 双蒸水 800ml A液 B液 （5） 4.磷酸盐缓冲液（PBS的配制 Na2 HPO4 1.15g KH2PO4 0.2g 双蒸水 200ml 依次称取各试剂并依次溶解在双蒸水中。 ⑴ 以0.104-0.112MPa15min高压灭菌 A液和B液。 ⑷ (5) 冷却后，将B液缓慢到入A液中并不断搅拌，最终 pH 7.0。 分装于500-1 000ml灭菌瓶中。 取1-5ml接于■中进行无菌检验。 贮存于普通冰箱。 A液和B液。 无钙、镁PBS 1 000ml 胰酶（1:250 ） 25g ⑴ （6） 无钙、镁PBS的配制 将上述PBS中的钙盐和镁盐去掉，将其他试剂溶解于蒸馏水中即成，无需分别配制 无钙、镁PBS胰蛋白酶溶液（2.5%）的配制 加胰蛋白酶于无钙、镁 PBS中，搅拌使其溶解。 用赛氏滤器过滤除菌，分装于 200-500ml灭菌瓶中。 取1-5 ml接于 ■培养基中进行无菌检验。贮存于-20C。 NaCl 8.0g KCl 0.2g KH2PO4 0.2g Na2 HPO4 1.15g 乙