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红豆杉内生真菌发酵培养过程中的碳源优化 江南大学药学系2001级药学班 丁雯 1绪论 1.1引言 肿瘤的治疗在很大程度上依赖于抗肿瘤药物，抗肿瘤药物研究方兴未艾。 紫杉醇（Paclitaxel,商品名Taxol）是从红豆杉树皮屮分离提纯得到的植物抗肿瘤 药，已有40余年的研究历史。由于其具冇良好的抗癌活性和独特的抗癌机理， 因而被认为是抗癌药物的“明星二U 1992年以來，紫杉醇已在许多国家成为治 疗卵巢癌和乳腺癌的重要药物⑴。 由于紫杉醇的?药源植物一红豆杉属植物生长缓慢，紫杉醇含量很低 （低于为树皮干重的0.015%）,而现有的资源又有限，因而紫杉醇的供应一开始 就受到人们的关注。 多年來人们一直在寻找能替代直接从植物中提取紫杉醇的方法［2、习。紫杉 醇的化学全合成虽已完成，但路线复杂，目前无商业价值；紫杉醇的半合成在 一定弹度上为缓解紫杉醇的供求矛盾；空年来分别从红豆杉属（血皿\中的短 叶红豆杉（工brevifolia Nutt.）、云南红豆杉（T.）蚀血必加$）、西藏红豆杉（工 wallichinana）等树皮中分离中得到能产生紫杉醇的内共生真菌，这无疑为解决 紫杉醇药源危机提供了一种新的途径。 1.2内共生真菌 内共生真菌（endophytic fungus）是一大类尚未被充分认识的真菌，它泛指 那些牛活在健康植株屮而不引起任何明显病害症状的所有真菌。在整个真菌发 展史上，内共生真菌的研究历史并不长⑷。 1924年，Lewis首次报道禾本科植物叶片中存在内共生真菌，但此后的 研究工作一直很少，直到近30年，对于植物内共生真菌的研究才趋于活跃。自 从 A. Stierle 证明 Taxus brenifolitz nutt 中的内共牛真菌 Taxomyces andreanae TTf 以产生紫杉醇，对于植物内共生真菌的研究更加引人瞩口⑸。 目前为止，内共生真菌生产紫杉醇产量也极低，这就需要进行多方面的 研究。本课题是以不同的碳源种类和配比对红豆杉内共生真菌发酵培养条件优 化的研究。 1.3本论文研究的内容 碳源在微生物屮是用于合成菌体的含碳物质及其骨架，并为微生物代谢 提供能量。除自养菌能以CO?作为唯一碳源外，大多数微生物是以有机含碳的 化合物做为碳源和能源。 红豆杉内共真菌发酵培养选用的碳源一般冇葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果 糖等。糖类的种类和浓度对细胞牛长的影响很大，本试验运用正交试验设计对 发酵培养基的碳源进行优化。 2 .材料和方法 2丄材料 2」」试剂 葡萄糖 AR 中国医药集团上海化学试剂公司 麦芽糖 BA 上海生物化学试剂公司 蔗糖 AR 上海化学试剂有限公司 花生饼粉 无锡第一制药冇限公司捉供 豆饼粉 无锡第一制药有限公司提供 NH4NO3 AR 宜兴市第二化学试剂厂 琼脂 BA 中国医药集团上海化学试剂公司 蛋口腺 BA 中国医纱集团上海化学试剂公司 酵母浸膏 BA 屮国医药集团上海化学试剂公司 MgSO4 AR 中国竟山区塔美化工厂 KH2PO4 AR 无锡市民丰试剂厂 CHCI3 AR 宜兴市展累化学试剂厂 CH3OH HPLC 上海陆都化学试剂厂 精密试纸 pH 5.4~7.0 上海三爱思试剂有限公司 2.1.2培养基 沙氏培养基： 葡萄糖20g,麦芽糖5g,蛋白腺10g,酵母浸膏5g,琼脂 15~20g,配成 1000ml, pH 自然,O.IMpa (121°C)灭菌 20 分钟，即得。 种子培养基： 葡萄糖 20g,花生饼粉 3g, MgSO43g, KH2PO43g, NH4NO33g, 配成 1000mlo 5()ml/3()0ml 瓶,0.1 MPa (12TC)灭菌 20 分 钟即得。 发酵基础培养基： 葡萄糖 20g,花生饼粉 10g,a 饼粉 10g,MgSO43g,KH2PO43g, NH4NO33g,配成 1000mlo 60ml/300ml 瓶，O.IMpa (121°C) 灭菌20分钟,即得。 上海一恒科技有限公司 上海一恒科技有限公司 上海申安医疗器械厂 无锡市空气净化设备厂 上海东亭科学仪器厂 江阴市科研器械厂星海生化设备有限公司2.1.3 上海一恒科技有限公司 上海一恒科技有限公司 上海申安医疗器械厂 无锡市空气净化设备厂 上海东亭科学仪器厂 江阴市科研器械厂 星海生化设备有限公司 MJ-2501AT型霉菌培养箱 MGC-300H型智能型人工气候箱 LDZX-40型立式压力蒸汽灭菌器 超净台 TDL-5-A冷冻离心机 口动高速组织匀浆机 旋转蒸发仪 2.1.4实验材料 菌种：Y1117,本实验室保藏(未鉴定) 标准品:Paclitaxel,购自Sigma公司 3.实验方法 3.1发酵捉取工艺流程图 斜面沙氏培养基 转接 种子培养基 （120r/niin23°C