单克隆抗体的制备与应用及新的剪接体抑制转录机制内科学(临床基础型).docxVIP

中国医学科学院北京协和医学院博士研究生毕业论文iASPP—SV 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生毕业论文 iASPP—SV iASPP spl ice variant iASPP剪接异 构体 M-MLV M—MLV reverse transcriptase 鼠源逆转录酶 IPTG Isopropylthio—B—D-galactoside 异丙基硫代一 B—D一半孚L糖 苷酶 McAb Monoclonal antibody 单克隆抗体 mg milligram 毫克 ml milliliter 毫升 Il g(p 1) mi cro—gram(microl i ter) 微克(微升) OD optic density 光密度 PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反 应 PIAF pET28a(+)一iASPP—SV—Full length PIAF质粒或者 蛋白 PIAS pET28a(+)一iASPP—SV—Small fragment PIAS质粒或蛋 白 RAI RelA associated inhibitot rpm Rounds per mi nute 每分钟转速 SDS sodiumdodeyl sul fate 十二烷基硫酸 钠 SDS—。PAGE Sodium dodecyl sulfate—‘polyacylamide gel 聚丙烯酰胺凝 electrophoresis 胶变性电泳 Spl Specific protein l ssDNA Salmon Sperm DNA 鲑鱼精DNA TriS trishydroxymethhylamino methane 三羧甲基氨基 甲烷 4 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生毕业论文中 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生毕业论文 中 文 摘 要 第一部分抗人iASPP单克隆抗体的制备 及研究应用 摘要 实验目的：应用脾脏内注射真核iASPP-SV表达质粒免疫的方法制备抗人 iASPP单克隆抗体(McAb)，并对其生物学特性进行初步研究。 实验方法：RT-PCR方法克隆iASPP—SV编码区cDNA。将扩增所得到的全长基 因克隆到真核表达载体pcDNA3．1(+)中，并将iASPP—SV基因全长和基因片段 克隆到原核表达载体pET28a中。诱导PIAF和PIAS载体在大肠杆菌Rosseta(DE3) 中表达PIAF和PIAS蛋白。通过盐酸胍变性溶解包涵体，并经镍柱纯化得到重组 PIAF和PIAS蛋白。 采用脾脏内注射真核pcDNA3．1-iASPP—SV(CIAF)免疫Balb／c小鼠3天后， 取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞(NSl)用传统的淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人 iASPP单克隆抗体。应用原核表达的iASPP—SV全长及iASPP—SV片段Hi s-tag融 合蛋白进行间接ELISA法筛选阳性克隆。并对亚克隆后的阳性杂交瘤细胞株所制 备的抗体的生物学功能进行了初步鉴定。 实验结果：我们利用RT—PCR方法从人白血病细胞系U一937qb克隆出癌基因 iASPP-SV编码cDNA，成功构建iASPP-SV表达载体PIAF、PIAS和CIAF，重组质粒读 码框和序列与预期一致。在IPTG诱导下，重组载体大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株， 表达产物经SDS—PAGE和western blot方法分析证实系PIAS和PIAF融合蛋白。利用 Ni2+鳌合层析的方法纯化PIAS和PIAF融合蛋白，经SDS鉴定其纯度超过80％。 用CIAF质粒通过脾脏内注射免疫所获得的小鼠脾脏细胞通过细胞融合、筛选和克 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生毕业论文隆化培养最后得到10株单克隆抗体细胞株。我们所获得的抗体能与天然iASPP—SV 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生毕业论文 隆化培养最后得到10株单克隆抗体细胞株。我们所获得的抗体能与天然iASPP—SV 和iASPP蛋白及重组iASPP—SV蛋白特异性结合，而且实验表明所获得的抗体可以 应用于western blot、免疫组织化学等实验。 实验结论： 本研究成功地应用脾脏内注射真核iAsPP—sv表达质粒免疫制各了 针对人iASPP蛋白的抗体，该抗体能够特异$只另UiASPP—SV和iASPP两个异构体。为 进一步对iASPP蛋白水平检测以及其功能、作用机制等实验研究奠定了良好的工 作基础。 关键词：iASPP iASPP—SV DNA免疫单克隆抗体 6 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生毕业论文第二部分 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生毕业论文 第二部分 iASPP-