N蛋白的表达纯化及免疫原性的初步.docxVIP

摘要摘要 摘要 摘要 人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)的核壳体蛋白(NC)含有两个高度保守的 锌指结构(CCHC型)，而它)乙在HIV-1生活周期的多个阶段多个步骤中都起到非 常关键的作用，因此核壳体蛋白成为近年来抗HIV药物研究的热点之一，但是出 于HIV高度的遗传变异性和抗HIv药物的高毒副作用及高昂的价格，HIV口服疫 苗在控制HIv感染和艾滋病流行中的重要生物医学干预作用便由此凸显出来。 本实验课题是从pNL4．3质粒经PcR得到HIV-1 NC的编码序列，然后克隆到 大肠杆菌表达载体pET-28a(+)才H应的酶切位点中，成功构建了重组pET-28a(+)原 核表达载体。将此重组质粒转化E．coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达并经Western blotting鉴定成功表达后，裂解菌体，进行纯化。重组蛋白存在于上清中，首先 采用Ni柱亲和层析初步纯化，超滤浓缩后通过凝胶过滤层析进一步纯化，收集 并浓缩重组蛋白，免疫新西兰雄兔，自制多克隆抗体并利用抗原亲和层析纯化 多克隆抗体。另一方面，首先利用杆状病毒载体pFastBacl作为供体质粒，将HIV-1 NC的编码序列转座至SJBacmid上，构建重组Bacmid．nc。脂质体转染家蚕BmN细 胞得到重组病毒后，通过荧光定量PCR钡,U定了重组病毒的滴度，用扩增后的重组 病毒感染家蚕细胞，以自制并纯化的多克隆抗体为一抗，Western blotting鉴定目 的蛋白NC在家蚕细胞中已成功表达，并自制抗体亲和纯化柱从细胞中进行了目 的蛋白的纯化。最后，用重组病毒分别大量接种家蚕五龄幼虫和蛹，Western blotting鉴定NC在家蚕幼虫及蛹中也得到成功的表达。 发病蚕蛹和正常蚕蛹分别经匀浆、过滤、离心、超滤、冻干后，研究小鼠 口服免疫效果。实验组包括原核免疫组(原核表达的重组蛋白+正常蚕蛹粉)和 真核免疫组(表达NC的发病蚕蛹粉)，对照组包括0．9％生理盐水组和正常蚕蛹粉 组。最终用间接ELISA检：狈0小鼠血清抗NC特异性抗体的反应情况。 本研究在利用家蚕杆状病毒表达系统成功表达HIV-1 NC抗原蛋白的基础 上，初步探讨了蚕蛹中表达的HIV-1 NC及其原核表达的重组蛋白对小鼠的口服 免疫原性，为利用家蚕杆状病毒表达系统低成本研发以HIV-1 NC为免疫原的HIV 口服疫苗提供了依据。 关键词：HIV．1，核壳体蛋白，表达，家蚕杆状病毒表达系统，口服免疫原性 Abstract--_____—________●_-●____●___-_—●‘_______-_-_-一____一__————--__●__—_-__-____-_-_-●-______-_-_——-______-’—______’____-__-_______-_________-—●-__-一 Abstract --_____—________●_-●____●___-_—●‘_______-_-_-一____一__————--__●__—_-__-____-_-_-●-______-_-_——-______-’—______’____-__-_______-_________-—●-__-一 Abstract The HIV-1 nucleocapsid protein(NC)contains two highly conservative CCHC·type zinc knuckle dLomains and plays an very important role in several stages of the life cycle of HIV-1，which makes nucleocapsid protein a researching hotspot of anti-HIV drugs in recent years．Owing to the great genetic variability of HIV and the high toxity and side effects of expensive anti．HIV drugs．the role of biomedical intervention of a new HIV oral vaccine is highlighted． In this study,the coding sequence of NC was amplified from pNL4．3 by PCR， and then cloned into the E coli expression vector pET-28a(+)．The recombinant plasmid was transformed into．E．coli