其他标书-日本血吸虫中国大陆株尾蚴的性别鉴定.docxVIP

登记序号 项目编号 科研设计书 项目冬称: 日本血吸虫尾坳性别鉴定应用技术的研究 承担单位: 单位地址: 邮政编码: 开户行: 帐 号: X项目负责人: 电 话: 职务职称: 填报日期 2004年7月28日 江苏省地方病协会 二OO四年制 立项依据: 血吸虫是一具有两性染色体的吸虫，有8对染色体，其中雌性性染色体为异配子体 （ZW）,雄性为同配子体（ZZ）。尽管雌性和雄性成虫阶段具有明显的性别二态性，可用肉 眼区别，但在幼虫阶段即毛坳、胞蝴和尾黝阶段，无明显的性别二态性，肉眼难以区别。 传统动物感染方法，是在实验室内取感染了血吸虫的鼠或其它啮齿类动物的肝、肠或粪 便收集虫卵，孵化毛蝴，用单只毛蝴感染单只钉螺，养殖筛选阳性钉螺?获得单性尾蝴，用 以感染啮齿动物，待:发育至成虫阶段，解剖动物收集成虫，用肉眼或在解剖显微镜下根据 形态学的差异，确泄感染尾拗性別。然而，单性雌性尾坳不能发冇到完全成熟的成虫，给鉴 別带来一定困难。同时常规方法需要花费时间长，日本血吸虫从尾坳感染动物到发育成熟至 少需3周。 采用分子生物学的方法，可快速鉴;^尾坳的性别。代表性差异分析（RDA）方法是基于 递减杂交法，用于发现两DXA基因组群间差异，是一种改良的扣除杂交法，并可用于分离基 因组间差异性片段。由于血吸虫为两性染色体的吸虫，其雄性为同性配子体（ZZ）,而雌性 为异性配子体（ZW）。RDA方法从宏观上看，系用雄虫染色体ZZ去扣除雌虫染色体中的Z, 从而获得ff染色体。Drew A.C?等（1995〉采用此方法分离出两段曼氏血吸虫雌性特异性序 列，并将其制备成探针，用Southern blot方法证实只与曼氏血吸虫雌性基因组DXA特异 性杂交。W1重复序列作为雌性特异性序列，存在于曼氏血吸虫波多黎各株生活史的各个阶 段。并根据曼氏血吸虫雌性该特异性序列设计出一对引物町a和Wlb。直接加入该引物 对单个尾坳作PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳。结果雌性尾蝴呈现扩增产物PCR-ffl条带?雄性 尾拗不呈现扩增条带。此方法能快速、可靠地用来鉴泄曼氏血吸虫尾坳的性别。基于曼氏血 吸虫尾坳性别鉴定的现有方法，为探索适合日本血吸虫尾拗性别鉴;^方法提供了理论和方法 依据。利用代表性差异分析（RDA）方法，分离出日本血吸虫雌性特异性序列，将此特异性 序列制备成DNA探针，用Southern blot方法鉴定日本血吸虫尾蝴性别。也可对此特异性 序列进行测序?设计一对引物，对单个尾蝴的DNA作PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，则雌性尾 坳呈现扩增条带，雄性则不呈现扩增条带，从而用PCR方法可快速鉴定日本血吸虫单个尾蝴 的性别。 研究日本血吸虫尾黝的性别鉴;^技术，建立日本血吸虫尾蝴快速鉴定应用技术有助于血 吸虫幼虫阶段生物学和生理学实验的研究：对血吸虫病疫苗评价方法的标准化、遗传学的研 究：及其流行病学、感染诊断和病理学研究结果的正确评价；不同性別尾黝的易感性和感染 比率以及减虫率（减雌率）和减卵率的正确评估等均具有重要的意义。同时为进一步开发适合我国国情的日本血吸虫尾坳性别鉴定试剂盒打下基础。 主要研究内容.关键技术、目标: **研究内容 ** 用代表性差异分析方法获得日本血吸虫雌性基因组DNA特异性序列。 **对特异性序列测序，设讣引物， ** 对特异性序列测序，设讣引物，PCR扩增。 2、** 2、 **日本血吸虫雄虫、雌虫基因组DNA的提取**代表性差异分析方法 ** 日本血吸虫雄虫、雌虫基因组DNA的提取 ** 代表性差异分析方法（RDA）和PCR。 ** 低熔点凝胶回收雌性特异性片段 **大肠杆菌E. coll TG1感受态细胞的制备技术、DA的重组和克隆筛选、重组D\A的转化 ** 及质粒DNA的提取。 ** DNA探针的制备和Southern blot验证方法 3、**雌性特异性序列测序和引物设计。 目标 建立一种简单、快速、灵敏的日本血吸虫尾蝴性别鉴定方法。 研究方法及技术路线 L用传统方法确定尾黝的性别，获取单性尾坳样本 1以逸坳法筛选出阴性钉螺用于感染，所有用于实脸的螺均筛选3次。 **以单只毛勉感染单只钉螺；螺感染后在光照培养箱中养殖90天或在春夏季室温条 件下养殖100天。逸坳法筛选出阳性钉螺，取单性尾勉感染小鼠，35天后剖杀，取成 虫确；^^尾拗的性别。并分別收集单性尾坳分别编号保存于-70t液氮备用。 用代表性差异分析方法分离日本血吸虫雌性特异性序列 **感染家兔4只，每只约用1500-1800条尾坳。45天后剖杀家兔，收集成虫，在解剖镜 下将成虫雌雄分开，分别保存于-70C液氮中备用。 **取雌虫.雄虫齐200条用基因组DXA提取试剂盒分别提取雌虫和雄虫的基丙组DNAo **用限制性内切酶Hindin对雌虫、雄虫DXA进行酶切