对的调控及其与胶质瘤恶性表型的关系.docxVIP

天津医科大学硕士学位论文中文摘要 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，由于恶性胶质瘤呈侵袭性 生长，增殖速度快，现有的综合治疗措施如外科手术切除、术后放疗、化疗和 免疫治疗难以达到根除，复发率很高，严重影响生存质量和生存期，临床预后 甚差。这充分反映了目前对脑胶质瘤的病因，发病机制及其治疗手段认识的匮 乏。为此，必须寻找与胶质瘤发生、发展相关的基因和信号通路，深入了解胶 质瘤的分子病理机制，在此基础上开拓胶质瘤治疗的新策略和新手段。 我室前期应用Atlas eDNA微阵列方法对63例不同类型脑胶质瘤的基因表 达谱进行了研究，除进一步证实以往发现的胶质瘤相关基因表达异常外，还发 现隔蛋白家族成员SEPT7在胶质瘤中表达显著降低，并经胶质瘤样本初步验证 111。在此基础上，我们构建了SEPT7的真核表达载体，将其转染至SEPT7显著下 调和缺失的胶质瘤细胞系，观察到SEPT7在体内、外均可抑制胶质瘤生长增殖 和诱导凋亡，并具有抑制胶质瘤细胞侵袭的作用；故初步认定SEFT7是一个新 的胶质瘤抑癌基因1241。此外，我们前期研究胶质瘤microRNA表达谱显示，在 435个人类microRNA中多个microRNA表达异常，其中miR-21、miR．221／222、 miR．19a／b和miR-30w5p等microRNA表达较正常组织显著上调【5l。为了寻找可 调控SEPT7表达的microRNA，我们搜索了预测microRNA靶基因网站，包括 TARGETSCAN，MIRANDA等，发现有50个microRNA，包括miR-19a／b和 miR．30a-5P在SEPT7 mRNA 3’UTR上有潜在的结合位点，并且和我室与南开 大学数学系合作构建的预测miRNA靶基因的HuMiT缸数据库(Ruan J，et a1．， HumMiTar：．A sequence-based method for prediction of human micrRNA targets． Algorithms for Molecular Biology 2008，3：16，国家自然科学基金资助项目“带 microRNA调控的胶质瘤细胞信号转导加权网络’’，编号结果最为一 致；故本课题重点研究了miR．19a／b和miR．30a-5p通过调控SE”7对胶质瘤增 殖、细胞周期进展、凋亡和侵袭的影响及其可能的作用机制。本课题研究分为 以下三个部分： 第一部分中应用Real time PCR的方法，检测了8个胶质瘤细胞系和43例 不同级别人脑胶质瘤组织中miR．19a／b和miR．30w5p的表达水平。结果表明这 两个microRNA在胶质瘤中的表达较正常组织显著上调，并与肿瘤级别呈正相 关。此外，我们又应用原位杂交技术对75例胶质瘤及5例正常脑组织制备的组 天津医科大学硕士学位论文织芯片检测两者表达，发现其与Real 天津医科大学硕士学位论文 织芯片检测两者表达，发现其与Real time PCR检测结果一致。 第二部分为miRol9a／b和miR-30a-5p对SEPl’7调控的研究。采用Real time PCR鉴定转染反义寡聚核苷酸抑制miR-19a／19b和miR-30a-5p表达的效果；应 用荧光素酶报告试验(Luciferase ReporterAssay)检测miR-19a／19b和miR．30a-5p 对SEPT7的直接调控关系；鉴于除SEPT7外，miRNA靶基因数据库预测胶质 瘤中两个重要的抑癌基因PTEN和P53分别也可能是miR-19a／19b及miR-30a-5p 的靶基因，因此我们也用荧光素酶报告实验检测了miR-19a／19b和miR-30a-5p 分别对PTEN和P53的直接调控。应用Western blot检测转染miR-19a／19b和 miR．30a-5p抑制物(AS-miR．1 9a／b．和AS．miR．30a-Sp)后SEP订表达变化； RT-PCR检测转染AS-miR-19a／b．和AS-miR-30a-5p后SEPT7 mRNA表达变化。 结果显示，转染AS-miR．19a／19b和AS-miR．30a-5p后肿瘤细胞miR-19a／19b和 miR．30a-5p表达明显下降：SEPT7表达上调；但SEPl7 mRNA表达无明显变化， 提示两者仅抑制SEPT7基因转录后的蛋白翻译。共转染AS-miR．19a或 AS-miR-19b和带有在SEm或PTEN 3’UTR作用区的重组荧光素酶报告质 粒pGL3后荧光强度增高，联合转染AS-miR-19a和AS-miR-19b时荧光强度增 高更明显；共转染AS-miR．30a-5p和带有在SEP”或P53