抗血清制备及沉默抑制子的鉴定.docxVIP

IIll IIll U IIII IIIIII II II| Y3057967’—— 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目：LSy!鱼迪型!鱼!擅鱼溘剑垒丞巡江魅控剑壬鲍鉴定 作者签名： 堕遮 日期： 鱼丛 年—厶月—卫日 万方数据 大连理工大学硕士学位论文摘 大连理工大学硕士学位论文 摘 要 百合无症病毒(三ity symptomless virus，LSV)是香石竹潜隐病毒属(Carlavirus) 中的一种，能够严重危害百合种球质量和鲜切花品质，是侵染百合的三大病毒之一。病 毒为单链正义RNA，含有6个开放阅读框(ORF)，编码4个蛋白，依5’至3’分别编码： RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，三基因连锁运动蛋白(TGBl．3)，外壳蛋白(CP) 和未知功能蛋白(16kDa)。 本研究以感染LSV的百合叶片为试材，通过RT．PCR克隆LSV基因16kDa。将该基因 连接至原核表达载体pET．28a(+)，重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达并 通过SDS．PAGE及质谱分析，证明得到高效表达的16kDa融合蛋白，蛋白以包涵体形式 存在。经镍柱纯化后得到纯度较高的蛋白。将纯化蛋白16kDa和TGBl分别作为抗原免疫 小鼠，制备16kDa和TGBl蛋白抗血清，间接ELISA检测抗血清效价较高。通过Westernblot 分析，制备的特异性抗血清能与16kDa，TGBl以及百合叶片总蛋白反应，均出现目的杂 交条带。制备的抗血清可用于病毒检测、蛋白质印迹、免疫组织化学等方面的研究。 为了验证LSV是否编码RNA沉默抑制子来干扰植物RNA沉默，以16kDa和TGBl 为研究对象，分别构建TGBl、16kDa和16kDaA的pMDaMl8．T载体，测序正确后连至 双元表达载体PTFl01．1，将获得的重组质粒通过农杆菌共浸润到转GFP本氏烟16c。将 TGBl、16kDa分别构建至双元表达载体pGRl07，侵染普通本氏烟。结果表明：16kDa 蛋白能抑制由GFP介导的局部沉默和系统沉默，其抑制作用较弱；能逆转系统沉默； 不能抑制由dsRNA引起的局部沉默；TGBl蛋白无抑制沉默功能。实时定量PCR和 Westernblot也证明了上述结果，即16kDa是LSV编码的RNA沉默抑制子。另外，TGBl 和16kDa均不能加重PVX病毒的症状，证明有些抑制子不会与PVX病毒协同作用。 将含有PTFl01—16kDa／TGBl质粒的农杆菌分别侵染烟草和百合，提取烟草和百合 线粒体的总蛋白，Western blot检测证明16kDa和TGBI都位于线粒体上。免疫胶体金 电镜观察发现16kDa和TGBl金颗粒在叶绿体中，但含量极少。以上结果表明：16kDa 和TGBl主要作用于细胞线粒体中，对叶绿体影响有限。 综上所述，本研究通过LSV编码蛋白TGBl和16kDa功能分析，初步判定16kDa 蛋白具有RNA沉默抑制子功能。16kDa和TGBl主要定位在细胞线粒体上。因此可以 推断，受百合无症病毒侵染植株外部症状不明显，无致病性，可能16kDa和TGBl蛋白 主要受体不是叶绿体，而是线粒体。 关键词：百合无症病毒；16kPa；TGBl；抗血清制备；沉默抑制子；亚细胞定位 万方数据 LSV LSV 16kDa／TGB 1抗血清制备及RNA沉默抑制子鉴定 Antiserum Preparation and Identification of RNA Silencing Suppressor ofLSV 16l(Da／TGBl Abstract 三咖symptomless virus(LSV)is belong to carlavirus，which is one of the three viruses infecting lily and it Can influence the quality of bulb and freshly cut flower badly．ne genome of，咖symptomless virus iS single．stranded positive RNA molecule which contains six open readiIlg frames and it Can encode four proteins fro