dna重组和基因转移.pptxVIP

第一节 目的基因与载体的连接;（二）具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接 ;;二、平末端DNA片段的连接;2、同聚物加尾法;3、衔接物连接法;三、载体与DNA片段酶切位点不匹配的连接 ;3、使用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段部分补平3′凹端转变成粘端。;四、cDNA与载体的连接;第二节 重组DNA分子的筛选与鉴定;一、遗传检测法;插入失活法筛选重组子;2、α—互补 ;二、物理检测法 ;2、R-环法 ;三、核酸杂交检测法 ;四、免疫化学检测法 ;用免疫化学法检测克隆在表达载体pUC8上的基因;五、DNA-蛋白质筛选法 ;1．杂交抑制???译 ;2、杂交选择转译 ;第三节 基因转移方法;（1）吸附阶段：完整的双链DNA分子吸附于感受态细胞表面。 （2）转入阶段：双链DNA分子解链，以单链形式进入细胞，而另一链则被降解。 （3）自身稳定阶段；外源质粒在细胞内又复制成双链环型DNA。 （4）表达阶段：即目的基因随质粒的复制子一起复制，并被转录、转译。;（二）转染;λ噬菌体的体外包装的原理：;二、重组DNA导入植物细胞的方法 ;①从烟草无菌苗中分离原生质体，并预培养24小时。 ②原生质体与农杆菌混合培养，原生质体浓度l05／ml、农杆菌l07／ml，20℃下保温32小时。 ③冲洗去游离的细菌，将原生质体培养在有抗生素(250mg／L万古霉素，200mg／L羧苄青霉素，200mg／L链霉素)的培养基中，这些抗生素抑制细菌生长，而对原生质体无毒害。 ④3周后，离心收集细胞团，再培养在无激素培养基上，2周内，转化的细胞团是激素非依赖性生长细胞团，在该培养基中可快速生长，而非转化的细胞团则生长很慢，最后变褐死亡。 ;（2）叶盘共培养法 ;（3）悬浮细胞或愈伤组织共培养 ;2、病毒介导的基因转移 ;（二）DNA直接导入法 ;;基因枪所用材料： （1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。;（2）电激法(electroperation) ;操作程序：;（3）微注射法（micro-injection） ;（4）激光微束法(laser microbeam) ;2．化学方法 ;3、种质系统法(germ line transformation system) ;（2）浸渍法 ;（3）胚囊和子房注射法 ;2、DEAE-葡萄糖转染技术 ;3、衔接物连接法;2、α—互补 ;五、DNA-蛋白质筛选法 ;（3）悬浮细胞或愈伤组织共培养 ;2、病毒介导的基因转移 ;操作程序：;2．化学方法 ;（2）浸渍法