介导敲除内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞基因.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 结果表明：通过生物信息学分析得到靶向于内蒙古白绒山羊基因组FGF5 结果表明：通过生物信息学分析得到靶向于内蒙古白绒山羊基因组FGF5 基因的79个潜在靶位点，从中选取了两个sgRNA序列，分别命名为FGF5．1 (AGAAGCGCCTCGCACCC A A A)和FGF5．2(CCCTGCCTCCTCCTCCTCCG)。 将两个sgRNA序列连接于pX330空载体，得到特异于白绒山羊基因组FGF5基 因的CRISPR／Cas9表达载体_px330—FGF5—1和pX330．FGF5-2。测序表明载 体构建正确。 利用pX330一FGF5．1和pX330一FGF5—2转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞， Surveyor错配酶酶切和测序验证表明成功的在靶位点进行了特异性切割和突变。 利用流式细胞仪通过随机挑选得到24个单克隆细胞系，特异性扩增FGF5基因 片段，测序结果表明其中4个细胞系在靶位点发生FGF5基因突变。对这4个敲 除FGF5基因的阳性克隆细胞系进行潜在脱靶位点验证，均未发生基因突变。 综上所述，本文根据内蒙古白绒山羊FGF5基因的基因组序列设计特异性 sgRNA，构建CRISPR／Cas9表达载体，转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞， 经过筛选与验证，得到4个定点敲除’FGF5基因的内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细 胞的单克隆细胞系，为进一步利