第2章基因工程上(西南大学普通生物学).pptxVIP

基因工程的优点;基因工程研究的理论依据;第一节 DNA重组;（1）核酸的组成;核糖;核苷;核苷酸;（2）DNA的结构;单链DNA;双链DNA;（1）DNA分子能在细胞内复制;（2）携带遗传信息;　　DNA分子上只有编码基因的片段才能转录合成相应的RNA（mRNA、rRNA、tRNA）。;mRNA;tRNA;核糖体RNA (rRNA);原核生物;2）mRNA翻译合成蛋白质;二、 限制性内切核酸酶和DNA片段化 ;在合适条件下，使每条DNA的一个磷酸二酯键断开，;III型酶：识别和切割相差限定数核苷酸。;限制性内切酶在DNA 分子上能识别的特定核苷酸序列;不同限制性??切酶产生DNA片段大小;;同裂酶（isoschizomer）;两条链断裂的位置处在识别序列的对称结构中心，产生的DNA末端是平齐的。;　　限制性内切虽然识别序列不同，但切割DNA片段具有相同的粘性末端。;4、限制性内切核酸酶反应系统;3）部分酶切;三、特异性DNA片段的PCR扩增;以单链或双链DNA为模板;DNA聚合酶催化合成DNA互补链的条件;最大特点：耐高温。;通过切口平移标记DNA分子，测序。;修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端，标记DNA末端，cDNA克隆中第二链的合成，DNA序列测定。;T4DNA聚合酶;合成的长度比其他聚合酶要长;逆转录酶（Reverse transcriptase）;3、PCR引物;4、DNA片段扩增系统;反向PCR（reverse PCR） ;不对称PCR（asymmetric PCR）;在一通用引物反转录的cDNA3’端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行PCR。;降解源自脱嘌呤作用，即DNA分子中碱基和戊糖间的氮糖苷键发生水解。 ;由于Taq酶只能以DNA为模板，当待扩增模板为RNA时，需先将其反转录为cDNA才能进行PCR扩增;在同一反应中用多组引物同时扩增几种基本片段;直接对载玻片上细胞涂片或组织切片进行PCR扩增;定量PCR（real-time PCR）;为达到某些特殊应用目的如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等，可在引物的5’端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析物结合位点等; 　　;最适温度37℃,;由大肠菌DNA编码的DNA 连接酶;2、DNA片段之间的连接;转化成平齐末端再连接;使DNA平齐末端的3-OH加上同聚核苷酸，产生具有poly(A) 、 poly(T) 、poly(G) 、poly(C)的粘性末端。;催化核酸分子脱掉5 P基团,转换成为5 –OH的酶。;　　;衔接物连接法;接头连接法;能够携带外源基因进入受体细胞的DNA分子。;一、质粒载体;外源基因插入的多克隆位点（MCS）;BR分别为Boliver Rodrigue首字母缩写;氨苄青霉素（Ampr，Tn3 ）;多克隆位点（multiple cloning site）;大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及编码β-半乳糖苷酶 α-肽链的DNA序列(lacZ基因);;pUC18 ;X-Gal is a noninducing chromogenic substrate for beta-galactosidase, which hydrolyzes X-Gal forming an intense blue precipitate. X-GaI is most frequently used in conjunction with IPTG in blue/white colony screening to detect recombinants (white) from non-recombinants (blue) ;IPTG induces activity of beta-galactosidase, an enzyme that promotes lactose utilization, by binding and inhibiting the lac repressor. IPTG is used to induce lacZ gene expression in cloning experiments;有多克隆位点;　　;　　根据Ti质粒诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，可以分成四种类型：;2）Ti质粒的结构;该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关;　　该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性;　　该区段上存在细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。;该区段基因调控Ti质粒的自我复制;　　使用无毒（non-oncogenic） —解武装（disarmed）质粒作载体，又称Onc－载体法。;将带有外源基因的T-DNA和v