第八章基因重组与基因分析pptPowerPoint.pptx

;第八章 基因重组与基因分析;第一节 核酸的分离纯化检测;第一节 核酸的分离纯化检测;第一节 核酸的分离纯化检测;保持防止核酸的生物降解 RNA酶抑制剂。RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 皂土。 皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。 DEPC（二乙基焦碳酸盐）。粘性液体，强核酸酶抑制剂 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意： DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。 容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。 剧毒。 其它：肝素、复合硅酸盐、RNase阻抑蛋白、氧钒核糖核苷复合物。;第一节 核酸的分离纯化检测;2. 核酸提取的过程与原理 细胞的破碎 细胞破碎的方法有：高速组织捣碎机捣碎；玻璃匀浆器匀浆；超声波处理法；液氮研磨法；化学处理法（SDS、LDS，吐温80等）；生化法（溶菌酶、纤维素酶等）。该过程要在低温下进行，并避免核酸酶对核酸的水解。 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力（核酸与碱性蛋白的结合）、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。 核蛋白有核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白两种，针对所提核酸的种类，要选择合适的方法。;核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 常用方法： 加入浓盐溶液（如NaCl）。核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；常选用0.14mol/L的氯化钠溶液提取RNP，而选用1mol/L的氯化钠溶液提取DNP。 加入SDS。SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能； 酚/氯仿抽提。酚/氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。可加上一定量的异戊醇可防止起泡和促使水相与有机相的分离（酚:氯:异戊醉=25:24:1）。;核酸的沉淀浓缩 核酸和蛋白质分离后，经离心后溶液分为三层：上中下分别是核酸溶液、变性蛋白质凝胶和氯???。接下来要浓缩核酸，沉淀是浓缩核酸最常用的方法。沉淀的具体方法见第二章。 优点：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。 一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0℃冰水，10-15min， DNA样品足可达到实验要求。 核酸的纯化 得到核酸沉淀后，还要要去除盐类，有机剂等杂质。通常是用乙醇洗涤，由于乙醇易挥发，最后只剩下比较纯的核酸。;核酸的浓度与纯度的测定 紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量 前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37μg/ml；RNA为40μg/ml。 测DNA： 纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。 OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。;核酸的浓度与纯度的测定 紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量 测RNA 纯RNA样品其OD260/OD280应介于1.7-2.0之间，OD260 /OD230比值应大于2.0。 若RNA样品OD260/OD280比值太小，有蛋白质或酚污染； 比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染； OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。 溴乙锭荧光法测定核酸的含量 如果DNA和RNA的量很少或有较多杂质的情况下，其含量可用溴乙锭荧光法测定。此法的比较主要基于目测，是估计水平。 电泳检测核酸的含量和质量 通过电泳，可以观察所得核酸样品降解情况，也可以通过与标准Marker亮度比较来估计所得核酸含量。;核酸的保存 DNA DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存； 长期保存样品中可加入一滴氯仿。 RNA RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 ℃保存； 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中； 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。 ;第一节 核酸的分离纯化检测;3. 植物总DNA的提取 注意事项