基因工程基本技术.pptxVIP

;主要内容;基因工程的基本技术之一;一、核酸提取技术;1、植物组织中基因组DNA的提取;ⅰ植物组织中基因组DNA的提取原理： 用机械研磨使组织和细胞破碎，然后加入SDS、CTAB等离子型表面活性剂，使细胞膜和核膜破裂，解聚核中的核蛋白（并与蛋白质形成混合物），然后在酚和氯仿等表面活性剂的作用下使蛋白变性，再经离心除去组织和变性蛋白，上清夜加乙醇使DNA沉淀。;再思考： 1、研磨破碎组织必 须在低温下进行。 ------为什么？ ;ⅱ 提取DNA的质量鉴定： DNA的相对完整性：凝胶电泳 DNA的纯度：测OD值;2、质粒DNA的提取;ⅰ质粒DNA提取方法：;抽提质粒DNA所需的溶液：;实验步骤;7、加等量的氯仿/异戊醇（V：V=24：1）抽提，离心； 8、移取上清液，加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃静置5min，离心，弃上清； 9、用70%乙醇洗DNA沉淀2次，离心，倒掉乙醇，吹干； 10、用TE（pH8.0，）溶解质粒DNA，并加入RnaseA达浓度为10μg/ml，37℃放置1小时 11、取1μL质粒DNA用于电泳检测。;ⅲ 抽提出质粒的构型：;抽提出的质粒三种构型电泳结果：;DNA的浓缩与纯化（P31-33）;二、凝胶电泳技术;琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳;（一）、影响电泳迁移率的因素;?操作简单； ?分辨范围：100bp-60kb； ? 有效范围：200bp-50kb； ? 分辨率：100bp左右;?常用于微卫星、测序分析； ?分辨范围：5-500bp； ? 分辨率：1bp;? 凝胶分辨DNA的能力：;4 、电泳缓冲液;电泳缓冲液的选择;（二）、电泳指示剂和DNA染色剂;? DNA染色剂;（三）凝胶电泳过程;1、单向电泳;? 中文名称：聚合酶链式反应;PCR操作流程;? 2、 PCR反应过程：;? 3、 PCR反应体系：;1）、引物（寡聚核苷酸）;2）、模板DNA： §基因组DNA、质粒DNA、其它DNA片段； §质量要求：不高 3）、Taq酶(热稳定性)： §常规酶 §高保真酶：ExTaq §La Taq酶 4）、反应缓冲液成分： § BSA、Tween20、DTT、明胶----保护酶作用 § Tris.cl提供缓冲作用;§(2)、 dNTP的浓度： 常用100-200μmol/L，不能低于20μmol/L，特异性、保真性；;§(3)、模板：主要考虑纯度及使用量 对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng.; ;以普通PCR 50?l reaction solution 为例);§ PCR thermal program;6、PCR的种类;;?（3）反向PCR： 根据已知序列扩增两侧序列的方法。;?（4）定量PCR; 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。; 原理：通过实时检测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析。初始模板量X0的对数值与C(T) 值之间呈线性关系： log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N ;;????PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 ;????研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。;荧光信号如何产生？;思考题1;ⅱ 提取DNA的质量鉴定： DNA的相对完整性：凝胶电泳 DNA的纯度：测OD值;抽提出的质粒三种构型电泳结果：;二、凝胶电泳技术;二、凝胶电泳技术;二、凝胶电泳技术;1）、引物（寡聚核苷酸）;§(3)、模板：主要考虑纯度及使用量 对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng.;