基因工程大肠杆菌表达系统.pptxVIP

前言;最佳的基因表达体系： ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。;宿主细胞的选择;宿主细胞分为两大类： 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等； 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 ;一、真核基因的大肠杆菌表达体系;大肠杆菌表达体系的优越性： 1. 对大肠杆菌的背景知识（完成基因组全测序哦），特别是基因表达调控的分子机理有（乳糖操纵子）深刻的了解； 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体； 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达； 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。;大肠杆菌中表达体系的不足： 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。;4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在； 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。 6. 大肠杆菌周质内存在各种内毒素。;克隆基因正确表达的基本条件 最基本条件：应该能够进行正常的转录和转译，以及在正常情况下还与转译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。启动子、终止子以及正确读码框（ORF）。 ;重要条件： 编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。 具有核糖体结合位点； 具有强启动子； ……;二、大肠杆菌的表达载体;外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理;（1）启动子;（2）转录终止子;（3）翻译起始序列;（4）翻译增强子;（5）翻译终止密码;2、常用的大肠杆菌表达载体;三、大肠杆菌的转化方法;2、Hanahan转化法;3、电转化法; 电转化法的转化效率受电场强度、电脉冲的时间和DNA浓度等参数的影响。;? 制备用于电转化的感受态细胞相对容易。 当细菌长到对数中期，冷却、离心，然后用冷却的去离子水反复清洗，最后用10%甘油重悬细胞，使其浓度为3?1010细胞/毫升，在干冰或液氮中速冻后置于-70 ℃贮存。;四、克隆的???核基因在大肠杆菌细胞中的表达;在大肠杆菌细胞不同部位表达外源蛋白质的优缺点;* Talmadge和Gilbert（1982）将外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的不同部位表达。结果： 细胞质中表达的大鼠胰岛素原的半衰期仅有2min左右，而表达在大肠杆菌周质中大鼠胰岛素原的半衰期延长了10倍以上。（原因：细胞周质中蛋白酶的含量低）;2、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性;（1）蛋白质的降解作用; 为了避免在大肠杆菌中发生外源蛋白质的降解，或将此降解作用控制在最低水平，已针对性发展出了许多种不同的技术方案。主要有：;（2）结构决定因子与蛋白质的稳定性;N-端氨基酸性质;（3）表达天然的蛋白质;（4）分子伴侣（molecular chaperone）稳定作用;（5）大肠杆菌突变体菌株与蛋白质的稳定性;五、影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素;1、启动子对克隆基因表达效率的影响; 此外，两个保守序列之间的距离也影响克隆基因的表达效率，这段间隔距离越接近于17个碱基，启动子的活性就越强。;（2）启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响 ;…ACAATTTCACAGGAAACAGGATCCGGGACTATTTTACCTATGGCGGTGATAATGGTTGCATGTACTAAGGAGGTTGTATG …TGTTAAAGTGTCCTTTGTCCTAGGCCCTGATAAAATGGATACCGCCACTATTACCAACGTACATGATTCCTCCAACATAC;（3）提高克隆基因表达效率的实验方案;2、质粒载体的生物学特性与基因表达效率; 质粒的拷贝数受质粒复制控制区和宿主菌的遗传背景影响。迄今所使用的绝大多数高拷贝数的质粒载体，都是由ColE1衍生而来的。 ColE1及其衍生质粒的复制，受两种负调节成分的控制：RNAI和Rom蛋白质。; RNAI是由ColE质粒DNA编码的长度为108 nt的不翻译RNA分子，它通过干扰RNAII的加工来抑制质粒的复制。;（2）质粒载体的不稳定性对表达效率的影响; 克服质粒丢失的方法：;3、mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响;※ 连接在SD序列后面的4个碱基成分的改变，会对翻